骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome，MDS）是一组起源于CD34＋细胞的恶性克隆性干/祖细胞性疾病,主要临床特征为一系或多系血细胞质、量异常，骨髓有病态造血表现，临床治疗反应差，高风险向急性髓系白血病转化［1］。再生障碍性贫血（aplasticanemia，AA）是T淋巴细胞功能亢进、通过免疫介导引起造血干/祖细胞过度凋亡的骨髓衰竭综合征［2］。二者的发病机制不同，但临床上均表现为全血细胞减少，不典型病例的诊断非常困难。为揭示MDS和AA本质，探讨特异性诊断与鉴别诊断指标和理想治疗靶点，本研究采用直接免疫荧光法、流式细胞术（flowcytometry，FCM）和CD45与侧向散射（sidescatter，SSC）设门方法，对MDS及AA患者骨髓原始细胞免疫表型特征进行了分析。
1资料与方法
1.1病例选择及分组所有病例均来自山东大学附属省立医院2007年5月至2008年1月门诊及住院患者，MDS组23例，男14例，女9例，中位年龄51（20～82）岁，其中难治性贫血（refractoryanemia,RA）组11例，难治性贫血伴原始细胞增多（refractoryanemiawithexcessblasts,RAEB）组12例，血常规均表现为二系或三系减少；AA组14例，男9例，女5例，中位年龄48（24～72）岁；正常对照组9例，男5例，女4例，中位年龄41（19～62）岁。诊断参照文献［3］。
1.2试剂和仪器
1．2.1试剂所有单克隆抗体均为美国BD公司产品，CD45标记Percp、CD25、HLADR、CD14、CD22、CD15、CD5、CD10标记异硫氰酸荧光素、CD34、CD3、CD13、CD33、CD7、CD19、CD20标记藻红蛋白，溶血素。
1.2.2仪器流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司的EpicsXL型；B120型低速自动平衡离心机。
1.3方法取肝素抗凝的骨髓液，调整细胞数至1.0～2.0×106/mL。分8管标记，抗体组合为CD25/CD34/CD45、HLADR/CD3/CD45、CD14/CD13/CD45、CD22/CD33/CD45、CD15/CD7/CD45、CD5/CD19/CD45、CD10/CD20/CD45及IgG1同型对照，加入骨髓液100?μL混匀，室温避光孵育15?min；每管加入溶血素1?mL，混匀，室温避光放置10?min；然后加入1?mLPBS，1?500?r/min离心5?min；弃掉上清液，PBS重复洗涤2次；取1?mLPBS悬浮细胞，在2?h内上流式细胞仪分析测定。用CD45和SSC散点图进行分析，每个测定管至少分析20?000个细胞，取日常工作中原始细胞团在散点图上出现的位置设门，然后进行其他结果分析。结果以各免疫标志占骨髓原始细胞的百分率表示。
1.4统计学处理采用SPSS13.0软件分析，数据以±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1干/祖细胞抗原表达见表1。MDS组CD34的表达率显著高于AA组和正常对照组，RAEB组显著高于RA组，RA组高于AA组；MDS组HLADR的表达率显著高于AA组和正常对照组，RAEB组高于RA组，RA组高于AA组和正常对照组。对每一组内CD34和HLADR行相关分析，显示RA组、RAEB组、AA组和正常对照组的相关系数分别为0.909、0.834、0.777和0.755，均为P＜0.01，CD34和HLADR之间存在显著正相关。nCD14MDS组RA组RAEB组AA组正常对照组23111214924.3±17.4*＃10.8±4.8＃36.4±15.5△*＃0.7±0.6*11.0±3.738.2±11.5*＃71.6±12.0△*＃24.2±8.921.1±5.334.2±6.7*＃52.7±11.7△*＃24.1±10.332.1±6.6*＃57.0±11.4△*＃5.2±3.0*23.3±9.128.3±6.7*＃21.4±8.0△*＃5.6±3.7*36.7±7.27.1±3.910.8±4.8△*＃4.7±3.35.4±2.3
*P＜0.05vs正常对照组；#P＜0.05vsAA组；△P＜0.05vsRA组2.2髓系抗原表达见表1。MDS组髓系早期抗原CD13、CD33的表达率显著高于AA组和正常对照组（P＜0.05），RAEB组高于RA组，RA组高于AA组和正常对照组；MDS组的髓系成熟抗原CD15的表达率高于AA组，低于正常对照组（P＜0.05），RAEB组低于RA组，RA组高于AA组，低于正常对照组。
计算髓系细胞分化指数DI=（CD13＋CD33）/CD15［4］。MDS组、RA组、RAEB组、AA组和正常对照组的DI值分别为（4.21±2.51）%、（2.40±0.41）%、（5.87±2.48）%、（1.12±0.21）%和（1.27±0.32）%。MDS组明显大于AA组和正常对照组（P＜0.01），RAEB组明显大于RA组（P＜0.01），AA组和正常对照组相比差异无统计学意义。
2.3单核细胞表面相关抗原CD14表达见表1。MDS组CD14的表达率高于AA组和正常对照组（P＜0.05），RAEB组高于RA组，RA组与AA组差异无统计学意义。
2.4T淋巴细胞系抗原CD3、CD5、CD7、CD25的表达见表2。MDS组CD3、CD5的表达率低于AA组（P＜0.01），RAEB组低于RA组；AA组的表达率高于RA组、RAEB组和正常对照组。MDS组CD7的表达率显著高于正常对照组，低于AA组（P＜0.01）；AA组高于RA组和正常对照组。MDS组CD25的表达率低于AA组（P＜0.01）。
近20年来，流式细胞术被广泛地应用于各种恶性血液病的诊断、特征描述、分类以及治疗后微小病变的检测,在MDS中的应用也越来越被重视。虽然MDS的诊断主要靠细胞形态学和细胞遗传学,但在实际工作中,由于病态造血类型多、缺乏公认的量化标准而存在重复性差、特异性差及灵敏度不够等缺点，而文献报道异常染色体核型的检出率也仅为40%～70%［5］。人们近10年来又发现了没有病态造血的MDS，髓系细胞异常免疫表型可出现于病态造血之前，且其异常程度与病态造血严重程度密切相关。Kussick等［6］研究显示，骨髓细胞学涂片检查与FCM和细胞遗传学结果密切相关。因为FCM能快速、多参数、客观地定性或定量测定单个核细胞膜上的多种抗原表达或同时测定胞膜、胞浆的抗原，其效率和精确度是免疫荧光显微镜或APAAP法所不能比拟的。应用CD45/SSC设门法，以CD45/SSC双参数可把各细胞群区分出来，若同时加上2个甚至3个荧光标记的单抗，则很容易识别非正常细胞群所表达的抗原，这在幼稚细胞所占比例低的情况下尤为重要［7］。
本研究应用三色流式细胞仪直接免疫荧光法，对MDS、AA及正常对照者骨髓的原始细胞进行了分析，结果显示，MDS组造血干/祖细胞标志CD34、HLADR、髓系早期标志CD13、CD33的表达率高于正常对照组，成熟髓系标志CD15的表达率低于正常对照组；且随RA组向RAEB组进展，CD34、HLADR、CD13、CD33的表达率逐渐增高，CD15的表达率逐渐降低。这与Ogata等［8］、Maynadie等［9］的研究结果一致，提示MDS造血干/祖细胞和髓系早期抗原表达增多，成熟髓系抗原表达减少；而CD34、HLADR的异常表达代表原始细胞的不成熟性和异质性，结合早期髓系抗原的异常表达，提示MDS异常克隆发生于造血干/祖细胞，且以髓系干细胞异常为主。造血恶性克隆保留一定程度的分化潜力,且增殖比较缓慢；随疾病进展，MDS的恶性克隆逐渐呈现优势性增长而对正常造血产生抑制，使骨髓中以异常的恶性克隆造血细胞为主；或者随疾病进展，恶性克隆造血细胞的分化潜力进一步下降，表现为RAEB较RA骨髓干/祖细胞及早期髓系标志表达率高，而成熟髓系标志表达低。
本实验中，正常对照组和RA组的CD34＋细胞占原始细胞群体的百分比均值为11.0％和10.8％，但是实际上上述病例由CD45/SSC设门分选的原始细胞群体占骨髓单个核细胞群体的比例均＜5％，因此，其免疫表型与形态学分型基本一致。同时说明正常人和RA患者的骨髓CD34＋细胞的增生可以是明显活跃的。
本研究中AA组造血干/祖细胞标志CD34的表达率为（0.7±0.6）％，而同为造血干/祖细胞标志的HLADR的表达率为（24.2±8.9）％，显著高于CD34。可能因为HLADR不仅分布于造血干/祖细胞，还分布于早期B细胞和激活T细胞表面，导致HLADR的表达率数值偏高。本研究结果显示，CD34和HLADR之间存在显著正相关，CD34和HLADR在各组的表达率一致，说明在进行组间比较时，HLADR仍然可以代表造血干/祖细胞的表达情况。
和前期的研究结果一致，本研究结果提示，AA患者骨髓原始细胞的CD34表达率显著低于正常对照组［10］，CD13、CD33、CD15的表达率亦显著降低，但结合其髓系分化指数与正常对照组相比无统计学意义，提示AA的发病机制主要是造血干/祖细胞减少，而不存在分化障碍。考虑AA患者很少有核型异常、预后良好、无恶性转化趋势等，支持AA为良性造血系统疾病；而MDS髓系分化指数显著升高，提示其造血干/祖细胞存在分化障碍，结合其多有核型异常、预后差、高风险向急性白血病转化，支持MDS为恶性克隆性干/祖细胞疾病。
MDS和AA是两类性质截然不同的疾病，但均可表现为全血细胞减少，临床上尚无满意的鉴别诊断方法。有些MDS临床表现不典型，血液学改变复杂，缺乏特异性，部分RA病态造血不典型，仅依靠形态学难以与AA相鉴别，尤其是骨髓增生低下时。本研究引入了髓系分化指数同时研究MDS和AA，这不仅有助于揭示二者发病机制的不同，亦为临床提供了简便、快捷、可靠的诊断及鉴别诊断方法。
Arjan等［11］研究显示，MDS骨髓单核细胞系分化抗原表达紊乱，92％的病例存在粒细胞或单核细胞生成异常，40％的病例存在单核细胞减少。刘丹丹等［12］研究显示，MDSCD14的表达与正常对照的差异无统计学意义。本研究结果显示，MDS单核细胞表面相关抗原CD14的表达率较正常对照增高，RAEB组高于RA组和正常对照组，RA组与正常对照组差异无统计学意义，提示MDS骨髓单核系存在异常，CD14表达紊乱。AA组与正常对照相比无差异，提示AA组单核系无异常。
本研究结果表明，T淋巴系抗原CD3、CD5、CD25在MDS组的表达率与正常对照组无差异，在AA组表达比正常对照组增高，提示AA患者存在T淋巴细胞功能亢进，验证了AA为免疫相关疾病。CD7在MDS组的表达率明显高于AA组和正常对照组，与CD34、HLADR表达增高相一致，支持多能干细胞、髓系干细胞与微小分化型急性髓细胞白血病细胞等均可表达CD7抗原，而非T淋巴细胞的特异性标志抗原。
本研究证实，B淋巴系抗原CD19、CD20在MDS组的表达率低于AA组和正常对照组，随RA进展至RAEB，表达率进一步减低；提示MDS患者B淋巴系早期抗原减少，与Amin等［13］、Sternberg等［14］的研究结果相符。可能与MDS骨髓内恶性克隆的扩增抑制了B淋巴系的增殖，或B淋巴系过度凋亡，或B系本身造血的异常有关。
总之，应用流式细胞仪直接免疫荧光法分析MDS和AA患者骨髓细胞免疫表型，不仅有助于揭示二者的发病机制，而且为临床提供了新的诊断、分型及鉴别诊断方法。