动态观察端粒酶活性在儿童急性淋巴细胞随着联合化疗的发展,儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)经诱导治疗后绝大多数可获完全缓解(CR),大部分患儿最终得以治愈。然而,20%～30%的缓解患儿随后又复发,并死于复发。因此,评价复发风险,进行早期治疗干预,实施个体化治疗方案是提高儿童ALL治愈率的关键因素。我们检测了ALL儿童诱导缓解治疗第14天时骨髓的原始细胞百分比和不同治疗阶段骨髓细胞端粒酶活性,研究其在ALL预后判断中的意义,现报道如下。
　　资料和方法临床资料　21例ALL为1993年1月至1998年12月我院住院患者,中位年龄7(1.5～12)岁,男14例,女7例。全部患儿的诊断和临床分型均根据小儿ALL诊疗建议3。形态学分型为L113例,L27例,L31例。临床分型为标危型(SR)13例,高危型(HR)8例。
　　治疗方法　根据小儿ALL诊疗建议制定的方法治疗,即采用泼尼松(P)、长春新碱(V)、柔红霉素(D)和左旋门冬酰胺酶(L)四种药(PVDL)诱导缓解治疗、环磷酰胺(C)、阿糖胞苷(A)和巯嘌呤(M)方案(CAM)巩固治疗,大剂量甲氨蝶呤(MTX)庇护所治疗,鬼臼噻吩甙(E)和阿糖胞苷方案(EA)早期强化。巯嘌呤加MTX和泼尼松加长春新碱交替维持。维持治疗期间采用COAP、PVDL和EA方案交替定期强化、甲氨喋呤和地塞米松定期鞘内注射治疗。全部患儿均未接受脑或脑脊髓放射治疗。
　　早期治疗反应评价　诱导缓解治疗第14天时常规行骨髓穿刺涂片检查,根据骨髓中原始加幼稚淋巴细胞的比例分为三级,<5%为M1,5%～25%为M2,>25%为M3。
　　端粒酶检测方法在不同治疗阶段行常规骨髓细胞学检查的同时,留取骨髓液标本1ml,以端粒重复序列扩增2银染色技术检测端粒酶活性。14例ALL自确诊起连续进行骨髓端粒酶检测,另7例ALL分别在连续CR24～36个月时开始行骨髓细胞端粒酶检测。
　　统计学处理　生存率计算采用Kaplan2Meier法,生存率比较采用log2rank检验。
　　结　　果治疗结果　21例患儿中19例在诱导治疗一疗程结束后获CR,CR率90%。2例未缓解者分别为BCR2ABL融合基因阳性和成熟B细胞型ALL。19例CR者自CR之日起随访,复发病例随访至复发日,连续完全缓解(CCR)者随访至2002年12月,中位随访时间为55(12～20)个月。6例在随访12～46个月时复发,其中4例为单纯骨髓复发,1例为单纯中枢神经系统复发,1例为骨髓和中枢神经系统联合复发。7例CCR时间为24～54个月,目前仍在治疗中,6例已停止治疗18～60个月。全组患儿5年无复发生存率为6515%。CR患儿5年无复发生存率为68.5%。
　　早期治疗反应与治疗结果　第14天的骨髓分级结果为M114例(67%),M23例(14%),M34例(19%)。14例M1患儿中,2例分别在CR后31个月(中枢神经系统复发)和42个月时复发。3例M2患儿中2例分别在12和32个月时复发,1例CCR已60个月。4例M3患儿中,2例未CR,2例CR者则分别在15和26个月时复发,无一例长期存活。14例M1患儿的5年无复发生存率为84.6%,7例M2加M3患儿的5年无复发生存率为15.8%,二者差异有显著性意义(P<0.05)。
　　不同治疗阶段端粒酶检测结果与治疗的关系14例ALL治疗前骨髓细胞端粒酶检测阳性率为92.3%,明显高于对照组的9.1%(P<0.001),亦高于CR时(33.3%)和CR后不同阶段(6个月者,16.7%:12个月者10%;24个月者12.6%;≥36个月者7.1%;P均<0.05)。CR时端粒酶阳性率(33.3%)高于对照组(9.1%,P<0.05),但CR后6个月时及以后各阶段的阳性率与对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。
　　14例初治ALL中2例未获CR者均为端粒酶阳性。在CR时,4例端粒酶仍阳性者6个月检查时,2例ALL端粒酶转阴,2例仍持续阳性,此2例中1例在随后半年内复发。在CR后12个月时1例ALL端粒酶由阴性转为阳性者随后复发。在CR后24个月时2例端粒酶阳性者(1例由阴性转为阳性,1例首次检查)随后复发,但同时亦有1例端粒酶阴性者出现中枢神经系统复发。1例在CR后30～36个早期治疗反应与端粒酶结果的关系　14例ALL从治疗前开始进行端粒酶检测,因而可分析早期骨髓治疗反应与端粒酶结果的关系。其中9例为M1、2例M2和3例M3,在诱导治疗1个疗程后,端粒酶阴性8例,阳性6例。M1、M2和M3型的端粒酶阳性率分别为11%(1/9)、100%(2/2)和100%(3/3,其中2例未CR)。
　　讨　　论儿童ALL是一种具有广泛异质性的疾病,尽早鉴定ALL预后因素,对判断预后、选择针对性治疗方案,从而提高长期无病生存率具有极其重要的意义。随着治疗方法的改变,常用的治疗前临床和生物学特征,已不再具有评价预后的意义,取而代之的是以治疗反应和微小残留白血病水平为代表的新一代与治疗相关的预后判断因素5、6。测定初次化疗后外周血和骨髓中原始细胞的减少程度和速度,作为一种体内药物敏感试验,能可靠地反映白血病细胞的药物敏感性、细胞周期状况和肿瘤负荷等特点,从而更准确地判断疾病预后和修订治疗方案。Gaynon等7对欧美15个试验组1万多例ALL回顾性分析显示,M3组的复发率是M1组的2.7倍,M2组的复发率是M1组的1.8倍。在多因素分析时,排除年龄、白细胞数及免疫表型对预后的影响,骨髓早期治疗反应仍具有显著的预后价值。本组21例儿童ALL第14天时骨髓原始细胞分级M1、M2和M3分别为67%、14%和19%,其M2和M3型比例高于美国儿童癌症研究组(CCG)报告的8%和8%,而与德国法兰克福2柏林2明斯特(BFM)组报告的28.5%和14.5%相似,这可能反映了不同群体的疾病特征或治疗方案的差异。随访结果显示,M1者的复发率明显低于M2和M3者,5年无复发生存率在两组间有显著差异,与国外多数文献报道的结果相一致。这表明尽管诱导治疗方案存在差异,但第14天的骨髓反应情况是判断ALL预后的重要而可靠因素。
　　端粒酶是一种独特的DNA聚合酶,以其自身携带的RNA模板而区别于一般的纯蛋白逆转录酶,其作用是在染色体末端不断添加端粒重复序列,以弥补端粒的丢失而使细胞无限增殖,因而在肿瘤细胞的长期生存中具有重要作用。急性白血病患者普遍存在端粒缩短及酶活性被激活8、9。我们对ALL患儿治疗过程中骨髓细胞端粒酶动态变化研究显示,治疗前ALL患儿中骨髓细胞端粒酶阳性率明显高于对照组骨髓,在有效治疗获CR后,大部分患儿端粒酶活性转阴,而未获CR者则持续阳性。随CR时间的推移,端粒酶阳性病例数稳定减少,在CR6个月以后端粒酶阳性率与正常对照组已无差异,而在CCR30个月及以上的14例中仅1例阳性,这与En2gelhardt等的研究结果相一致,与白血病患者治疗后体内肿瘤负荷变化相一致。在CCR期不同治疗阶段端粒酶持续阳性或由阴性转为阳性的患儿大部分随后复发,而持续阴性者中除1例髓外复发外,余均长期无病生存。这提示端粒酶能反映白血病细胞的生物特征和体内肿瘤负荷情况,可能是适用于各型ALL的微小残留白血病检测,是判断分子学缓解的有益指标,而且可避免以T淋巴细胞受体基因或免疫球蛋白重链基因重排及白血病细胞异常抗原表达作为检测指标的局限性。定期动态监测端粒酶活性对早期发现ALL复发有重要意义。