白血病细胞检查_中医血液病网

yatao 2008年10月06日

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白血病细胞检查

白血病细胞的检查方法经过了形态学(morphology,M)、免疫学(immunology,I)、细胞遗传学（cytogenetics,C）、分子生物学(molecular,C)检查的漫长过程，目前已发展为综合这4大类检查结果将白血病按MICM进行分型的时代。MICM分型不仅对白血病的诊断具有重要意义，而且为白血病的诊断、治疗、判断预后等具有重要价值。回顾这一演进过程，将有助于了解这4大类检查的来源、内容和意义，在白血病的诊断、治疗和研究中，正确使用他们，并进一步发展他们。

一、白血病病细胞的形态学检查

白血病细胞和形态学检查先后经过光学显微镜、组织化学、活组织染色、位相显微镜、透射和扫描电镜检查到目前的共聚焦扫描显微镜等发展阶段。

17世纪，显微镜的发明和改良为观察血细胞创造了条件，但当时只能分辨红、白细胞，血小板；直到1880年，Ehrlich发明了血细胞染色法，以后又经过Romanowsky，Giemsa，Wright，Pappenheim等人的改良，细胞学和血液学家才能借以对白血病细胞深入观察形态学特点，例如到1857年才认识急性白血病细胞；辨认原粒细胞仅始于1900年，1910年证明和描述了巨核细胞和血小板。随着细胞学检查的深入开展，白血病细胞形态学观察也逐步细致起来，但用一般染色在显微镜下只能观察白血病细胞的形态，不能了解其功能和内部化学结构，因此一些学者又研究和发现了活体和细胞化学染色法。活体染色检查可以见到不同的白血病细胞有不同的活动规律，例如中性分叶核粒细胞具有活动的特点，而原粒细胞活动则少；活体检查法可见到线粒体，线粒体在原始细胞中很多，成熟细胞中少，原淋细胞线粒体很少。此外在中性红活体染色下，还可见到特殊颗粒，空泡。通过细胞化学染色，可以观察白血病细胞中的核酸、核糖核酸、糖原（PAS反应）、脂类（苏丹黑）、酶（非特异性酯酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶等）。这些染色称为细胞组织染色，这对鉴别粒、淋、单核细胞有着十分重要的意义。

第二次世界大战结束以后，随着各国经济的恢复和发展，组织化学和细胞化学技术的不断改进，20世纪40年代末50年代初，位相显微镜特别是透射电镜的发明和应用，使人们对白血病细胞的观察，达到超微结构水平，并进入功能和形态学结合新阶段。1944年Blackman编绘的小儿血液图谱问世，1949年已有较系统和详尽的图谱，Custer血液及骨髓图谱。国外又出版了临床血液学和细胞学图谱。1954年，法国的Bessis出版了血细胞电镜检查图谱。新中国成立以前，国内还没有一本系统的血液学和白血病细胞的专著。新中国成立以后，原上海第一医学院（现复旦大学医学院）编写了《实验诊断学》，对血细胞和白血病细胞作了描述和介绍。到1965年，原广慈（瑞金）医院检验科主任徐福燕教授编写了《临床血液细胞学》专著，1967年沈阳医学院依Wright和Giemsa染色，编写了《血液学和细胞学图谱》，这是我国血细胞形态学和白血病细胞描述较为详尽的两本重要著作，从而白血病细胞的形态学检查标准有了初步的依据。1976年法、美、英三国的白血病细胞形态学专家，根据各自的经验的标准，对白血病的骨髓和血片进行复查，通过商讨，订出了急性白血病的FAB分型，1985年经过修改和补充，提出了急性白血病的分型（FAB型）和诊断标准，现已为世界各国血液学和细胞形态学家普遍采用。1980年全国白血病分类分型讲座会通过了白血病分型建议，1986年全国白血病分类分型协作组，综合国内外关于白血病分型的新进展，对急性白血病分型的形态学诊断标准作了规定，并沿用至今。以上所述的国内外分类分型法，都是依据细胞形态学的特点，包括细胞化学染色而制定的。包括细胞化学在内的、以Wright、Giemsa染色为基础的细胞形态学（即M）是白血病诊断的主要依据，并用于指导分类、分型、判断预后。如急性淋巴细胞与急性非淋巴细胞白血病的治疗不同，预后也不相同。急性非淋巴细胞白血病中，M3治疗效果较好，预后也较好。少数情况下需要依靠电镜检查，才能最后确定白血病的细胞类型，如毛细胞白血病细胞，有时显微镜下不能鉴别，在电镜检查下可见多毛的形态特点。位相显微镜、活体染色、扫描电镜检查，在常规检查中已少用或不用，在研究工作中仍应用，最近发展的激光聚焦扫描显微镜，有助于对白血病的深入研究。

二、白血病病细胞的免疫检查

（一）各系白细胞免疫表型

随着免疫学的进展，人们认识到各种肿瘤细胞都有能被免疫T细胞或抗体识别的分子结构，称为肿瘤抗原。肿瘤抗原不仅与肿瘤细胞的性质有关，而且与其生长成熟程度有关，而这些抗原与其相应的正常细胞又有密切关联。白血病细胞与其他肿瘤细胞一样，髓系、淋巴系、单核系、巨核细胞的免疫表型不同，但所表达的抗原与其同期正常细胞的抗原相同。白血病细胞的免疫表型常以CD（分化群抗原）表示。有关各系细胞免疫表型以及他们的特点参阅第四章。

（二）急性白血病的免疫分型

始于20世纪80年代早期，除通过免疫分型进一步将髓系、单核系、淋巴系细胞白血病分型外，主要是能进上步将急性B细胞系白血病，分为急性早期B前体细胞白血病（CD34+、TdT+、CD19+、CD10-）普通型急性白血病（CD10+），急性前B细胞白血病（CD10、CIg+），急性B细胞白血病SmIg（+）。急性T细胞系白血病分为急性早期T前体（CD7、TdT+），急性T细胞白血病（CD7、CD2+）。具体分型参阅第四章。

（三）白血病免疫分型产意义

白血病免疫分型不仅反映了免疫学基础研究的进展，而且在临床上也有重要意义。

1．补充形态学检查的不足形态学检查虽是白血病诊断的基础，但单依形态学观察，有时不能区分细胞的类型及其分化成熟的程度，尤其是淋巴细胞。例如有的原始细胞只根据形态检查，不易肯定或区别属于哪一系细胞。有的早期甚至是开始分化的细胞，有髓系和淋巴系抗原表达，这在形态学检查下是无法区别的，也说明发病的白血病细胞可能来自尚未完成定向分化的早期细胞，或反映白血病细胞的克隆性。根据免疫分型，可将淋巴细胞白血病分为T细胞和B细胞两大类。急性T细胞白血病又可分为早、中、晚T细胞白血病，如早期T细胞CD2阴性，中晚期T细胞CD2阳性。根据1986年FAB协作组第一次MIC分型法，急性B细胞白血病分为早期B前体细胞型，普通型，前B细胞型和B细胞型急性淋巴细胞白血病。

2．免疫分型与白血病预后的关系

（1）与急性非淋巴细胞白血病预后有关的抗原：一般来说，急性髓性白血病（AML）的白血病细胞表型越不成熟，预后越差。AMLCD34表达增强，预后差，若AML白血病细胞表达淋系相关抗原，如CD2、CD7、CD4、CD9和CD10，一般预后较差。有一组研究结果显示，表达CD7的AML大多发生在M1型AML，且多见于青壮年男性，外周血白细胞及原始、幼稚细胞较高，对现行的AML化疗反应较差，预后不良。凭形态分型的M0型AML，POX阴性，淋巴系及巨核细胞系的免疫表型阴性，但有的髓系细胞的表型阳性，占急性白血病的3%～5%，预后差。据欧洲协作组的研究，若AML（急性早幼粒细胞白血病除外）白血病细胞表达全髓免疫表型（MPO+、CD13+、CD33+、CD65+、CD117+），则化疗后完全缓解率为81%，只表达上列髓系免疫表型中4种以下的AML，缓解率只有48%，缓解期及生存期较前种类型短。

（2）与急性淋巴细胞白血病（ALL）预后有关的抗原：急性普通型ALL表达D19+及CD10+，预后最佳。成人ALL中，髓系抗原阳性率可达21%，其中CD33阳性率15.7%，CR率明显低于阴性病例。

随着各种抗原的发现和单克隆抗体的制成，免疫表型研究在不断地深入。它与白血病之间的关系，也在不断地得到深入了解。上面所陈述的仅是一些初步结果，但已可以看出它在白血病的诊断、判断预后以及指导治疗方面所起的重要作用，以后还会有新的发现，丰富这方面内容。

三、白血病的细胞遗传学检查

现已普遍认为，白血病的发病基础是基因突变，有的已知，有的尚未明确。众所周知，基因是沿着染色体纵轴直线地排列的，基因的突变有的仅为局部核苷酸的异常，正常排列失常，点突变等，不能反映到染色体的大体检查上，但有的不少影响到染色体，其异常可表现为某一染色体的缺失（del）、相互易位（t）、重复（dup）、倒位（inv）等。由于基因是决定每一个遗传性状发育的基本功能单位，在白血病方面决定白血病的有关特点，因此从染色体水平来了解、研究和发现白血病的基因突变，是继白血病细胞形态、免疫表型检查之后诊断和了解白血病性质的新技术和途径。这种从染色体水平来诊断白血病并予以分型的方法，称为细胞遗传学检查和分型（C）。

随着染色体检查方法的不断改进和深入，从分辨Q带、R带、G带、C带法到目前的原位杂交、染色体涂抹等新技术的应用，有关白血病的染色体异常在其分型、治疗、判断预后方面，日益发挥其重要作用。20世纪50年代初，人们虽已用各种方法研究白血病的染色体改变，但直到1960年Nowell和Hungerford发现慢性粒细胞白血病（CML）的白血病细胞中有一种异常染色体，称为费城（Ph）染色体以后，才推动了染色体检查在白血病中的应用。有关AML及ALL中已知的染色体异常，参阅第五章。有的染色体异常具有特征性，如M3的t（15；17）（q22；q11-21），M2b的t（8；21）（q22；q22），M4EO的in（16）（p13；q22）。有的染色体异常好发于儿童ALL，如t（4；11）（q21；q23）白血病多发生在婴儿。儿童ALL中约有5%的患儿有t（9；22）（q34；q11）染色体异常（Ph¹⁺）；成人ALL中有20%～30%，M1型AML中3%～18%Ph¹⁺。Ph¹⁺的ALL属于高危，对化疗效果差，存活期短、伴有染色体11q23易位的AML大多原粒高，预后差。根据染色体异常可将AML的预后危险程度分为高危[有-5，-7，del5（-5q），3q异常，复合染色体异常]；中危（染色体正常，+8，+21，+22）；及低危[染色体t（8；21），t（15；17），in（16）]，据报道，化疗完全缓解率分别为56%～63%，70%～86%，84%～91%，5年存活率分别为12%～26%，35%～41%，56%～65%。

此外，染色体检查，还发现了一些新的急性白血病亚型，如M3有t（15；17），t（11；17）之分，前者对维A酸治疗有效，后者无效。又如M2型t（8；19）（q22；q13）亚型，免疫表型与t（8；21）M2型AML相同，CD13、CD33、CD19阳性。

四、白血病的分子生物学（M）检查

分子生物学的概念最早于1950年提出，其含义是从分子水平来研究生物体及生命现象。经过40余年的研究和进展，由于技术不断改进和提高，现已有许多可靠的方法检查引起疾病的基因核苷酸顺序、结构和功能改变。前已述及，白血病是基因突变引起的疾病，因此，随着分子生物学的发展，白血病的发病机制也开始从分子水平上进一步阐明。过去在细胞遗传学水平上所发现的异常，现在已明确所涉及的基因，以及基因突变的部位和性质。例如第11号染色体的q23所累及的基因名为MLL（髓-淋白血病基因），在AML中与MLL配对的基因不下30个，常见于M4、M5型AML。又如第21号染色体q22所涉及的基因名为AML-1，在t（8；21）M2b型AML中与21号染色体上的ETO基因融合，AML-1-ETO融合基因是M2b型白血病的发病基础。

分子生物学检查对白血病诊断及分型有以下几方面意义。

1．补充MIC检查的不足细胞遗传学是从染色体水平来检查的，而分子生物学检查是从基因、分子水平着手。有时染色体检查结果不能肯定，或不能发现基因异常，往往可以通过分子生物学检查予以明确。如t（9；22）的BCR-ABL融合基因，t（1；14）（p32；q11）的TAL-1-TCRD融合基因，t（10；14）（q24；q11）的HOX-11，TCRA融合基因等。染色体检查可以阴性，用PCR法可以检测到有关的融合基因。

2．发现新的亚型例如M3有4种亚型，其中t（11；17）（q23；q11），t（11；17）（q13；q11）的MIC检查结果十分相似，无法区别，但所累及的融合基因，分别为PLZF-RARα及NUMA-RARα，只有依靠分子生物学方法检查才能鉴别。前者对维A酸治疗无反应，而后者在体外对ATRA敏感。

3．为研究白血病的发病机制打下基础因为只有从基因水平进行研究，才有可能阐明白血病的发病机制。例如M2融合基因，AML-1-ETO基因可抑制共转录激活复合物（内含去乙酰化酶），可引起粒细胞分化障碍而造成白血病。抑制去乙酰化酶使组蛋白乙酰化，可使白血病细胞恢复分化而成熟。临床上应用G-CSF（促进分化）和苯乙酸（抑制去乙酰化酶）治疗已有成功的例子。

白血病的分子生物学检查，现在正处于开始阶段。应用PCR、原位杂交等技术，可以在细胞水平研究某一基因的表达，如Bcl-2、P53、WT-1、多药耐药、肺耐药蛋白基因等。已证明，表达多药耐药基因，肺耐药蛋白Bcl-2、WT-1基因的急性白血病对化疗的疗效较差，缓解率较低，预后差。因此随着方法学的改进和简化，费用的降低，检测这些基因有可能被纳入白血病的分型，扩大MICM的分型，发展成为MICMG（形态、免疫、表型、细胞遗传学、分子生物学、特殊基因表达）分型，除诊断外，对白血病的预后，指导治疗将起重要作用。

2003年8月22日星期五完稿

第二章

白血病细胞形态学

第一节传统血膜染色：Romanowsky染色的变迁

血膜染色最早是Ehrlich用橘黄G、甲基绿作用生成的“中性”染料，由于甲基绿有3个氮原子，因而被错误地定名为“三酸”染料，嗜碱和嗜酸的名称即来源于此染料染色结果。Romanowsky用伊红和美蓝染疟疾病人的血膜，这是血膜染色的雏形；以后英国的Jenner用甲醇溶解沉淀，德国的May和Grunwald也发现此现象，Nocht观察到发霉的美蓝贮存液染色效果最佳，他称之为多色性美蓝，Leishman用一个溶液兼染色和固定，这就是目前应用的Leishman和Wright方法。另一方面，Giemsa用AzureⅠ和Ⅱ代替美蓝配制染料，并在溶剂中加上甘油，以增加溶解度和易于与水混合。

20世纪70年代，显微分光光度计和电脑的广泛应用，传统的描述已开绐被精确科学的数字来表达。在这个形势下，Giemsa染色又被研究，获得了下述一些结果。

一、料标准化

1891年，Romanowsky首先应用的染料是“陈旧”美蓝和伊红的混合液，它将细胞核染成紫色而胞浆呈蓝色。由于“陈旧”美蓝难以标准化。因此Marshall(1975)提出标准化的Romanowsky染料的配方为：美蓝9.0mg、天青B17.0mg、伊红13.0mg，溶解于20ml1:1甘油甲醇中，使用时，以0.00132MpH6.8的Sorensen磷酸缓冲液100ml稀释，染色时间为10min。1978年Wittekind等指出用纯天青B及伊红Y可得到完美的Romanowsky-Giemsa染色(R-G染色)，美蓝可省去，这顼工作已被Galbraith(1980)、Marshall(1981)和Lapen(1982)重复证实。为此，“标准”配方改为：天青B130mg，伊红Y65mg分别溶于50ml甲醇中作为贮存液，用时以0.033MpH6.8的Sorensen磷酸缓冲液稀释。

二、 R-G染色效果的机制

Zipfel(1984)用显微分光光度计，将小鼠的纤维母细胞(LM细胞)用天青B及伊红在pH约为7.0时进行染色，获得细胞核呈紫色和胞浆呈蓝色的结果，用DNA酶及RNA酶消化之后，核呈蓝色而胞浆不着色，这表明DNA和RNA是生物学染色物质。R-G染色之后，核有3个吸收波段：A1(15400/cm,649nm)、A2(16800/cm,595nm)，这是DNA与天青B的单体及二聚体结合的结果；第3个吸收波段称为RB(18100/cm,552nm)，被认为是DNA-高聚合天青B-伊红Y的复合物，也就是细胞核呈紫色的基础。用人工复制DNA-高聚合天青B-伊红Y（用小牛胸腺的DNA）其吸收波段与Romanowsky染色的细胞相同。Muller—Walz(1987)观察结果也基本一致。亦观察到染料浓度/核酸浓度为5.28时，DNA-天青B复合物带有阳性电荷，这个电荷成为伊红Y的靶而形成DNA-天青B-伊红复合物，即Giemsa染色中的紫色。胞浆染色的吸收光谱也有3个带(pH≈7)：A₁^，(15300/cm,654)、A₂^，(16900/cm,592nm)及A₃^，(17600/cm,588nm)。出现这3个波段的原因被归因于RNA与天青B的单体、二聚体或多聚体结合的结果，但A₂^，和A₃^，有重叠，因此一般的吸收波段为A^，(-17000/cm，588nm)。

三、染料分析

Marshall(1975)早已指出各种商品染料的染色性能不一，Lubrano(1977)曾将各种Giemsa和Wright染料商品进行高性能液相色图定量分析，发现各种型号的混合染料中的thiazine各不相同，有的还混有不明性质的成分。因此用商品染料不利于显微分光光度计定量分析。即使用单一的天青B和伊红Y配制“标准”液，也可因染料的不纯而影响结果，这是由于商品的天青B中混有杂质。Zipfel(1981)用天青B-BF4，这个染料是分析提纯的，它的单体在乙醇溶液中的Σ(15.61/v)M为(9.40±0.15)×104/M.cm，作为标准的染料样品。

四、 R-G染色对各种血细胞染色的结果

Galbraith(1981)将“标准”液染色后的各种血细胞进行色泽分析，结果发现两种染料各有两个聚合状态（单体和二聚体）。这就成了4种成分，在各个血细胞的结构中这4种成分的比例不同，因而形成血细胞多色彩的表现。

五、微分光光度计对各系血细胞成熟过程的研究

Flanders(1984)用“标准”的Romanowsky染料研究细胞核在细胞成熟过程中的染色改变，将以往专著中的各种颜色如Digg等描述为亮红到深蓝，Miale认为是紫色到蓝色，Wintrobe则形容为紫红色到蓝紫色的各种描述语言转变成计算机形式的数字。

六、影响R-G单色效果的各种因素

R-G染色变幻莫测，除了染料本身的因素外，其他因素也同样重要，其中主要有：

（一）固定

不同固定剂对R-G染色的影响使得习惯于HE染色的病理学家大为吃惊。Giemsa染色用于组织切片，只有Sternberg是成功的，但他用的固定剂是甲醇，蚁醛与组织中的氨基结合，有利于碱性染料着色，但在R-G染液中，它能与天青B结合而使染色失败，含铬混合液固定的标本，其细胞核不染成紫色（而且是不可逆的）。湿片固定和空气中晾干的标本的R-G染色也有差别，空气中晾干对核着紫色有稳定作用。

（二）pH对R-G染色的影响

血液学家熟知Giemsa染料的pH值对红细胞色泽的影响，pH低时，伊红着色，pH高时呈蓝绿色，由于thiazine仍与负电荷结合，pH7-8时，R-G效果中的紫色深于pH6-5时，当Ph3.5时，R-G效果全部抑制，只出现2种颜色即蓝绿色的核和红色的细胞浆。

（三）缓冲液成分对R-G染色的影响

一般组织化学对缓冲剂的要求仅仅是稳定pH的作用，但对R-G染色，缓冲液成分对染色结果也有影响，其中以HEPES缓冲液Ph6.8效果最好，这是由于二价酸的盐效应较好，它不与组织中阳离子形成不溶性化合物。还有当缓冲液浓度达到0.05M时，R-G染色变浅。

（四）溶剂对R-G染色的影响

劣等的甲醇和乙醇对R-G的影响极大。溶剂中的有机酸（即使是醋酸或其他弱酸）也使紫色消失。丙酮、四丁醇对染色也有影响。由于DMSO有利于天青B-伊红Y复合物的稳定，能溶解多量伊红Y，不挥发，毒性低，易与甲醇及水混合，并对空气中干燥红细胞的耐受性优于甘油，因而被用来代替甘油。但DMSO在高浓度也会影响染色（干扰生物基质获取染料），因此在染液中不可高于10%。同样，增加甲醇浓度，紫色将不出现。

（五）天青B和伊红Y的比例对R-G染色的影响

由于染色后细胞中各种成分的不同色泽取决于天青B（单体及二聚体）和伊红Y（单体及二聚体）4种成分的比值。因此染液中天青B与伊红Y的比值必然影响染色结果。由于染色质染成紫色的吸收峰在555nm，这被认为是thiazine:伊红摩尔比例为2：1的结果。用纯天青B和伊红Y的重量比为15：1时可得到外周血和骨髓的满意的血细胞染色。但是自从Giemsa第一张配方后，所有配方都采用一个安全比例，即碱性染料的量超过酸性染料。

（六）染色时间

Horobin(1987)研究R-G染色的时间影响，他延长染色时间到28小时，结果所有细胞成分均染成紫色。他的结论是：R-G染色中的紫色选择性只是一个反应速度现象。

七、 R-G染色出现问题的可能原因

问题	可能原因
1．玻片上出现沉淀	（1）缓冲液浓度太高；（2）甲醇（或DMSO）含量太低；（3）染液太陈旧；（4）温度太高。
2．染色浅（色调平衡）	染料含量少，由于（1）染料不纯；（2）称量或稀释错误；（3）染料沉淀——见1。
3．白细胞核呈蓝色	（1）染料含量太少——见2；（2）甲醇（或DMSO）含量太高；（3）pH太低；（4）染色时间长。
4．中性粒细胞不出现颗粒	同3
5．中性粒细胞呈“中毒”	（1）pH太高；（2）染色时间长；（3）AzureB浓度太高。
6．红细胞及嗜酸性颗粒太蓝	（1）pH太高；（2）缓冲液不合适；（3）染色时间太长。

八、 Wittekind1987年介绍的一种R-G染色法及其与其他方法的差别

Wittekind（1987）使用的R-G染色法：

涂片常规甲醇固定。

贮存液：天青B（thiocyanate）750mg溶于75mlDMSO

伊红Y（酸）120mg溶于25mlDMSO

混合后，置于深色瓶中

室温下可贮存数月

染色步骤：染血片，以1：50V/V的HEPES pH6.5缓冲液稀释，染10～30min；染骨髓片，以1：25V/V稀释，染15～35min，过缓冲液，过蒸馏水，晾干

此法与商品染料的差别如下：

成分	商品染料	R-G染色法
天青B	混有其他thiazine	纯
伊红Y	两个阴离子能与天青B形成中性盐（沉淀）	中性化的Eosinic酸在非水溶液中与阳离子不发生作用
其他离子	主要是Cl- 少数是Br-	CSN-（BF₄-）
染料浓度	无确定标准	天青B 伊红Y
摩尔比天青B/伊红Y	4：1～8：1	14.8：1
贮存液溶剂	甲醇甘油（各种比例）	DMSO
染色液稀释液稀释倍数 PH	蒸馏水或磷酸缓冲液 1：10 6.8～7.0	HEPES缓冲液 1：50或1：25 6.5

第二节各期正常血细胞形态

在普通显微镜下用瑞氏（Wright）染色方法进行血细胞形态观察仍是当前骨髓细胞形态检查常用的手段。正常的骨髓细胞随着分化过程形态亦按一定规律变化，即胞体由大变小（除早幼粒细胞较原粒细胞稍大外）；胞浆量由少至多、RNA含量亦渐减少、颗粒由无而多；胞核从大变小、核形自圆至不规则形；核染色质由细致变为粗糙、块状；核仁从大而清晰至隐匿、进而消失。在病理情况下，以上演变规律可发生紊乱。

一、红细胞系

（一）原红细胞

原红细胞胞体直径15-20μm，圆形或椭圆形。胞质量少，常有伪足，染深蓝色，不透明感，核周可有淡染区，无颗粒。胞核大而圆，约占胞体的4/5。核染色质颗粒状，细而均匀，染深紫红色，核仁清晰，通常1-3个。

正常骨髓原红细胞比例较少，仅占0-2%。在红血病、红白血病中增多，并常伴有形态异常；在骨髓增生异常综合征（MDS）、巨幼细胞贫血、急性造血功能停滞、溶血性贫血等疾病也可增多。

（二）早幼红细胞

早幼红细胞胞体直径10-18μm，圆形或椭圆形。胞质较丰富，蓝色或深蓝色，不透明，无颗粒。胞核圆形，占胞体的2/3以上，核染色质呈粗颗粒状，可有浓集。核仁隐匿或消失。

正常骨髓早幼红细胞占1%-5%。在红血病、红白血病时早幼红细胞比例明显增多并伴形态异常；MDS、巨幼细胞贫血、溶血性贫血以及缺铁性贫血等疾病时其比例亦常增多。

（三）中幼红细胞

中幼红细胞胞体直径8-15μm，圆形或卵圆形。胞质较丰富，随细胞的成熟过程核糖核酸量逐渐减少，而血红蛋白含量随之增多，因此中幼红细胞阶段呈多色性。胞核较小、圆形，约占胞体的1/2，核染色质呈致密块状，副染色质明显，如碎墨样排列，无核仁。

正常骨髓中幼红细胞占6%-24%，是骨髓中最常见的一种幼红细胞。增多见于溶血性贫血、急性失血性贫血、MDS、巨幼细胞贫血、缺铁性贫血、原发性血小板减少性紫癜（ITP）急性期、红血病、红白血病、脾功能亢进（脾亢）等，是骨髓造血功能旺盛的征象；减少可见于再生障碍性贫血（AA）、纯红再障、放射线病、急性白血病以及部分MDS等疾病

（四）晚幼红细胞

晚幼红细胞胞体直径9-12μm，圆形或卵圆形。胞质量丰富，呈橘红色或灰红色，趋向完全血红蛋白化。胞核小而圆，占胞体的1/2以下，核染质固缩成团块状。

正常骨髓晚幼红细胞占6%-10%。在缺铁性贫血、MDS、溶血性贫血、红白血病、红血病、巨幼细胞贫血等疾病时增多；减少可见于再障、纯红再障、白血病等疾病。

（五）成熟红细胞

成熟红细胞胞体直径7-8μm，平均7.2μm，呈边缘稍厚、中央较薄的双面凹平盘形。橘红或淡红色，中央较淡染。

成熟红细胞为晚幼红细胞脱核后以育而成。在一些疾病成熟红细胞表现为形态异常，如小细胞低色素性贫血常见于缺铁性贫血、铁粒幼细胞贫血、地中海贫血、慢性感染以及铅中毒等；球形红细胞常见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血以及脾切除术后；椭圆形红细胞大量出现在遗传性球形红细胞增多症，正常人、巨幼细胞贫血、严重缺铁性贫血等情况下亦可见；靶形红细胞多见于海洋性贫血，在缺铁性贫血等低色素性贫血时亦可见到；口形红细胞在遗传性口形红细胞增多症及急性乙醇中毒时比例增高；镰状红细胞则见于镰状细胞性贫血；在尿毒症、肝脏疾病、血浆β脂蛋白缺乏症、烧伤时可见棘形红细胞，但需除外制片不佳所至；弥散性血管内凝血、微血管病性溶血贫血、癌转移等疾病成熟红细胞的碎片可呈盔形、刺形、星形等形态各异的裂红细胞；多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、高纤维蛋白原血症等情况红细胞呈缗钱状排列。

二、粒细胞系

（一）原粒细胞

原粒细胞胞体直径10-18μm，圆形或随圆形。胞质量少，呈透明天蓝色围于核周，通常无颗粒，白血病原粒细胞胞质中可见Auer小体。胞核大，圆形或随圆形，约占胞体的4/5。核染色质呈细粒状，分布均匀平坦，核膜甚薄。核仁小而清晰，2-5个。

正常情况下，骨髓中原始粒细胞极度少见，仅占分类的2%或更少。当原始粒细胞大于等于30%时，则提示急性非淋巴细胞白血病（ANLL）M1、M2、M4、M6型，慢性粒细胞白血病（CGL）急粒变，以及类白血病反应等疾病；骨髓增生异常综合征（MDS）原粒细胞亦可增多，但比例小于30%。

（二）早幼粒细胞

早幼粒细胞胞体比原粒细胞大，直径12-20μm，呈圆形或椭圆形。胞质量较原粒细胞多，淡蓝色，核凹陷处的核旁淡染区表示有发达的高尔基体，胞质中含有大小不一、多少不等、分布不均的紫红色非特异性的嗜苯胺蓝颗粒。白血病性早幼粒细胞浆内易见Auer小体。胞核大，位于中央或偏位，圆形或类圆形。核染色呈颗粒状，比原始粒细胞粗，开始有浓集现象。核仁可见或消失。

正常人骨髓中早幼粒细胞占1%-8%。ANLL的M3型骨髓中颗粒增多的异常早幼粒大于或等于30%；ANLL的M2型、M4型、早幼粒细胞性类白血病反应、CGL早幼粒细胞可增多；粒细胞缺乏症恢复期早幼粒细胞亦可一过性增多。

（三）中幼粒细胞

中幼粒细胞及以后各阶段粒细胞胞质出现特异性颗粒，根据颗粒的不同，中幼粒细胞分为中性、嗜酸及嗜碱3种类型。

1．中性中幼粒细胞：胞体直径10-18μm，圆形或椭圆形。胞质量较多，嗜苯胺蓝颗粒基本消失，出现细小均匀浅红色中性颗粒。胞核占细胞的2/3-1/2，常偏于一侧，圆形或椭圆形，有时近中央一面扁平或略有凹陷。核染色质粗糙，浓集呈小块状，核仁消失。

中性中幼粒细胞在正常骨髓中占5%-15%。ANLL的M2b型核浆发育明显不平衡的异常中幼粒细胞占30%以上。CGL、粒细胞性类白血病反应、某些感染以及骨髓增生性疾病（MPD）等中幼粒细胞比例可较正常增高。

2 嗜酸中幼粒细胞：胞体直径10-20μm。胞质内充满0.2-0.7μm大小均匀、排列紧密，有立体感、带折光性、橘红色特异性嗜酸颗粒，形如剥开的石榴状。有时见少量散在嗜碱颗粒，称为“两性颗粒”。胞核及核染色质与中性中幼粒细胞基本相似。

正常骨髓嗜酸中幼粒细胞占0-3%。在嗜酸粒细胞白血病、CGL、霍奇金病、高嗜酸粒细胞综合征，各阶段嗜酸粒细胞明显增多；寄生虫感染性疾病、皮肤病、变态反应性疾病、药物过敏、胃肠道疾病以及肿瘤等疾病嗜酸粒细胞反应性增多。

3 嗜碱中幼粒细胞：胞体直径10-15μm，胞质内含有数量不一，分布散乱、大小不匀、染色深浅不等的紫黑色粗大特异性嗜碱颗粒，往往掩盖核与浆，致使胞核轮廓不清，核染色质模糊。

正常骨髓嗜碱中幼粒细胞极度少见，占0-0.1%。在CGL嗜碱粒细胞变、嗜碱粒细胞白血病则异常增多；CGL加速期和慢性期、MPD、放疗后反应等疾病，嗜碱粒细胞比例亦增高。

（四）晚幼粒细胞

1 中性晚幼粒细胞：胞体直径10-16μm，圆形。胞质量较丰富，含有细小浅红色中性颗粒。胞核较小，占细胞的1/2以下，形态不一，常呈肾形、带状、豆状、落花生形，核一侧凹陷明显，核横径最窄处大于最宽处的一半。核染色质较中幼粒细胞更粗糙，浓集成块，核仁消失。

正常骨髓中性晚幼粒细胞占9%-15%。CGL、类白血病反应时明显增多；粒细胞缺乏症、感染、烧伤、中毒、脾亢、MDS、MPD等疾病骨髓中性晚幼粒亦可增多。

2 嗜酸晚幼粒细胞：胞体直径10-16μm。胞质中充满颗粒粗大、橘红色嗜酸颗粒。胞核呈肾形、半月形，其凹陷程度小于核直径的一半。核染色质粗糙成块。

3 嗜碱晚幼粒细胞：胞体直径10-14μm。大小不等的嗜碱颗粒分布在胞质内及胞核上。胞核呈肾形、花生形，轮廓模糊不清。

（五）杆状核粒细胞

1 中性杆状核粒细胞：胞体直径10-15μm，圆形。胞质量丰富，充满浅红色中性颗粒。核形不一，呈S形、U形等，核凹陷程度大于核直径的1/2，核最窄径大于最宽径的1/3。核色质粗糙成块。

正常骨髓中性杆状核粒细胞占10%-25%，CGL、感染、脾亢等疾病时可增多。

2 嗜酸杆状核粒细胞：胞体直径10-16μm，胞质中充满大而圆形嗜酸颗粒，核形呈马蹄形或弯曲杆状。

3 嗜碱杆状核粒细胞：胞体直径10-12μm，圆形。胞质及胞核上可见大小不一的紫黑色嗜碱颗粒。胞核呈弯曲杆状，核形模糊。

（六）分叶核粒细胞

1 中性分叶核粒细胞：胞体直径10-15μm，圆形。胞质量丰富，含有大量浅红色中性颗粒。胞核分成2-5叶，叶间有核桥或核丝相连，核最窄径小于最宽径的1/3。核染色质浓集成深红色块状。

正常骨髓中分叶核粒细胞占7%-30%，明显增高见于慢性中性粒细胞白血病、感染时；减少见于粒细胞缺乏症、再障、急性白血病、急性造血功能停滞等疾病。

2 嗜酸分叶核粒细胞：胞体10-16μm，胞质中充满粗大圆形嗜酸颗粒，胞核多分成两叶，呈豆点状。

3 嗜碱分叶核粒细胞：胞体10-12μm，嗜碱颗粒常分布于胞质内或掩盖胞核上，胞核分叶，但核叶模糊。

三、单核细胞系

（一）原单核细胞

原单核细胞胞体直径14-22μm，圆形或不规则形。胞质量多少不一，通常较其他原始细胞丰富，呈蓝色或灰蓝色，不均匀、不透明、边缘不规则，可有伪足突出，一般无颗粒，可有Auer小体。胞核较大，类圆形或不规则形，易见凹陷、折叠现象。核染色质呈细网状，疏松交织，可见2-3个大而明显的核仁。

正常骨髓中通常看秒到原单核细胞。在急性单核细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、慢粒急单变的骨髓中可见到大量原单核细胞；在红白血病、MDS、慢性粒-单核细胞白血病的骨髓中亦可出现一定量的原单核细胞。

（二）幼单核细胞

幼单核细胞胞体直径15-25μm，类圆形或不规则形。胞质量较原单核细胞丰富、蓝色或灰蓝色，常有伪足或芽状突出，胞质内可出现细小嗜苯胺蓝颗粒，亦可有Auer小体。胞核大小不一，椭圆形或不规则形，有凹陷、切迹或折叠、扭曲、分叶。核染色质较原单核细胞稍粗糙，排列成条索状或疏松网状。核仁隐匿或消失。

幼单核细胞在正常骨髓中很少见到。急性单核细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、慢粒急单变等疾病时大量增多，在慢性粒-单核细胞白血病、MDS、红白血病等疾病也可见幼单核细胞。

（三）单核细胞

单核细胞胞体直径12-20μm，胞体圆形或不规则形，可见伪足。胞质量丰富，蓝色或灰蓝色，半透明状，可见许多细小而分布均匀的嗜苯胺蓝颗粒，部分胞质中可见空泡。核形不规则，可呈肾形、马蹄形、分叶状，常伴有切迹、凹陷、扭曲、折叠。核染色质为网状或条索状。无核仁。

正常骨髓单核细胞占0.5%-5%。恶性增多主要见于慢性粒-单核细胞白血病、MDS、霍奇金病、恶性肿瘤、急性单核细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病以及化疗和放疗恢复期等；良性增多见于粒细胞缺乏症、亚急性细菌性心内膜炎、伤寒、结核、黑热病、病毒感染、系统性红斑狼疮、类风湿必关节炎、肝硬化、结节病、脾切除后等疾病。

四、巨核细胞系

（一）原巨核细胞

原巨核细胞胞体大，直径15～45μm，类圆形。胞质量少，深蓝色，边缘不规则，可呈泡状、伪足状突起，无颗粒。胞核较大，呈不规则圆形。染色质较粗，呈粗网状或条纹状。核仁2～4只，较大，明显或隐匿。

原巨核细胞在正常骨髓中罕见，占巨核细胞的0～5%。在急性巨核细胞白血病中比例明显增高，≥30%。MDS、急性原发性血小板减少性紫癜、脾亢中可稍增多。

（二）幼巨核细胞

幼巨核细胞胞体更大，直径25～50μm，外形不规则，胞质量增多，常有伪足，染蓝色，可有部分浅红色，有时出现少量细小嗜天青颗粒，胞核大，常有重叠、扭曲感，呈肾形或分叶状。核染色质粗糙，呈块状或条索状，核仁消失或有残迹。

幼巨核细胞在正常骨髓中较少见，占巨核细胞2%～10%。在急性原发性血小板减少性紫癜、Evan综合征、巨核细胞白血病、脾亢、骨髓增生性疾病等幼巨核细胞比例可增高。

（三）颗粒型巨核细胞

颗粒型巨核细胞胞体巨大，直径40～70μm，甚至达100μm。胞质量丰富，染蓝灰色和淡红色，充满细小均匀的嗜苯胺蓝颗粒，有时可密集，但无血小板形成。胞核较大，不规则形或分叶状、环状。核染色质粗条索状。无核仁。

正常骨髓颗粒型巨核细胞占巨核细胞10%～50%。增多常见于原发性血小板减少性紫癜（ITP）、Evan综合征，在急性大出血、CGL、骨髓增生性疾病、脾亢、感染时亦可增多；减少常见于再障、急性白血病、骨髓病性贫血、某些感染、药物中毒、放射病以及先天性巨核细胞缺乏症等疾病。

（四）产血小板型巨核细胞

产血小板型巨核细胞胞体巨大，直径40～70μm，可大至100μm。胞质量丰富、多呈粉红色、充满大小不等嗜苯胺蓝颗粒，已有血小板形成，常在细胞周边明显。胞核形态不规则或分叶闲谈。核染色质粗糙不匀，呈团块状。

正常骨髓中产血小板型巨核细胞较多，占巨核细胞20%～70%。增多见于慢性骨髓增生性病、脾切除术后、感染等疾病；ITP、Evan综合征、再障、急性白血病、骨髓病性贫血等疾病产血小板型巨核细胞减少，血小板生成减少。

（五）裸核型巨核细胞

产血小板型巨核细胞的胞质全部脱落后，释放大量血小板，即成裸核。细胞核不规则形，核染色质粗糙、固缩。

正常骨髓中裸核型巨核细胞占巨核细胞0～20%。在ITP、CGL、急性失血、骨髓病性贫血等疾病时可增多。

（六）血小板

血小板胞体小，直径2～4μm，呈圆形、类圆形、星形或不规则形，由颗粒区和均质区组成，常3～5个成堆聚集。

巨大血小板见于血小板无力症、MDS、巨核细胞白血病等疾病；小血小板见于再障、缺铁性贫血民及白血病等疾病。

五、淋巴细胞系

（一）原淋巴细胞

原淋巴细胞胞胞体直径10～18μm，圆形或椭圆形。胞质量少，透亮天蓝色或淡蓝色，呈狭带绕于核周，一般无颗粒。胞核较大，常位于中央或偏于一侧，圆形或椭圆形，部分细胞核有切迹可见凹陷或折叠。核染色质呈致密而均匀的颗粒状，较原粒细胞的核染色质稍粗，核膜，核膜清晰。核仁规则而清晰，1～2个。

原淋巴细胞产生于淋巴组织的生长中心，正常骨髓中很难见到，小儿骨髓中偶见。恶性增生见于急性淋巴细胞白血病（急淋）、恶性淋巴瘤骨髓浸润、慢性淋巴细胞白血病（慢淋）急性变以及CGL淋巴细胞变等疾病；淋巴细胞型类白血病反应的骨髓中亦可见原淋巴细胞。

（二）幼淋巴细胞

幼淋巴细胞胞体直径10～18μm，圆形或类圆形。胞质量少，淡蓝色无颗粒，也可见少量嗜天青颗粒和空泡。胞核圆形，可见凹陷或折叠。核染色质稍粗，较紧密。核仁隐慝或消失。

幼淋巴细胞是原淋巴细胞与成熟淋巴细胞之间过渡阶段，在正常成年人骨髓中极少见，小儿骨髓中少量可见。在急淋、幼淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤骨髓浸润等疾病的骨髓中可大量出现；在传染性单核细胞增多症、传染性肝炎、淋巴细胞型类白血病反应、慢淋以及放射线等疾病的骨髓及外周血中亦可见到幼淋巴细胞。

（三）成熟淋巴细胞

成熟淋巴细胞分大小两型。大淋巴细胞胞体直径12～15μm，圆形。胞质量较多，淡蓝色，无颗粒或可见少量嗜苯胺蓝颗粒。胞核类圆形，可有切迹。核染色质浓集，有时见核仁残迹；小淋巴细胞胞体直径6～10μm，圆形、椭圆形或轻度不规则形。胞质量很少，淡蓝色，通常无颗粒。胞核圆形，可有切迹和凹陷。核染色质成块状，染紫红色。无核仁。

正常骨髓中大淋巴细胞少见，占4%～5%，小儿骨髓中较多。小淋巴细胞占10%～20%。在慢淋，恶性淋巴瘤骨髓浸润、巨球蛋白血症等疾病骨髓中淋巴细胞大量可见；在早期放射线病、铅中毒、苯中毒时大淋巴细胞比例增高。传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、淋巴细胞型类白血病反应、结核病、百日咳、某些病毒感染，以及再障、粒细胞缺乏症骨髓中淋巴细胞增多或相对增多。

六、浆细胞系

（一）原浆细胞

原浆细胞胞体直径14～20μm，圆形或椭圆形。胞质量较丰富，深蓝色，不透明，边缘染色更深，核旁较淡染，无颗粒，可见空泡。胞核圆形或椭圆形，居中或偏位，约占细胞的2/3。核染色质颗粒状，较均匀。核仁清晰，2～5个。

正常骨髓中不易见原浆细胞。多发性骨髓瘤、浆细胞白血病的骨髓中可大量出现。

（二）幼浆细胞

幼浆细胞胞体直径12～20μm，椭圆形。胞质量丰富，深蓝色或呈多染色性，可见核旁淡染区、空泡、少量嗜苯胺蓝颗粒以及Rusell小体。胞核圆形或类圆形，约占细胞的1/2。核染色质有浓集现象。核仁陷匿或消失。

正常骨髓中幼浆细胞极少见。在多发性骨髓瘤、浆细胞白血病骨髓中幼浆细胞可明显增多；传染性单核细胞增多症、恶性肿瘤、原发性淀粉样变、肝脏疾病、霍奇金病、某些病毒感染等疾病骨髓中有时亦可见幼浆细胞。

（三）成熟浆细胞

成熟浆细胞胞体直径8～15μm，椭圆形。胞质量丰富，染蓝色或紫丁香花色，有泡沫感，核旁淡染区明显，多无颗粒。胞核较小，占细胞1/3～1/2，圆形，明显偏位。核染色质浓集成块，呈车轮状或龟背状排列。无核仁。

正常骨髓中浆细胞少见，占0～2%。在多发性骨髓瘤、浆细胞白血病中易见；在某些感染、恶性肿瘤、肝硬化、免疫性疾病以及药物中毒等骨髓中浆细胞增多；单核细胞白血病、传染性单核细胞增多症、再障、粒细胞缺乏症等血液病，骨髓中浆细胞增多或相对增多。

第三节白血病细胞形态学分型

传统的白血病细胞形态分型根据白血病自然病程长短分为急性和慢性两大类；按细胞起源不同又可分为髓细胞系、淋巴细胞系以及特殊类型白血病。随着免疫学、细胞遗传学和分子生物学的迅速发展，人们对白血病分型有了不少新的认识。当今，造血和淋巴组织肿瘤性疾病新的WHO（World Health Organization）分类法成为国际上一种新的分类方法，该分类法的疾病类型不仅将细胞形态学、免疫形型、核型分析以及融合基因相结合分析，还提出一些诊断的新概念。1997年WHO分类法中髓系肿瘤及淋巴细胞白血病分类建议归纳于表2-1，2-2。

由于目前国内白血病细胞免疫分型、染色体核型分析以及融合基因的检测尚未普及，当今绝大多数医院仍以FAB分型法为白血病的主要诊断手段。本章节着重介绍白血病的形态学，有关白血病化学染色、免疫学、遗传学及分子生物学分型详见第三至六章。

表2-1 WHO髓系肿瘤分类的建议

骨髓增殖性疾病（MPD）

Ph染色体[t(9；22)(q34；q11)，BCR/ABL]阳性的慢性髓系白血病

慢性中性粒细胞白血病

慢性嗜酸粒细胞白血病/高嗜酸粒细胞综合征

慢性原发性骨髓纤维化

真性红细胞增多症

原发性血小板增多症

不能分类骨髓增殖性疾病

骨髓增生异常/骨髓增生性疾病（MDS/MPD）

慢性粒-单核细胞白血病（CMML）

不典型慢性髓系白血病(aCML)

幼年型粒-单核细胞白血病（JMML）

骨髓增生异常综合征

难治性贫血伴环形铁粒幼细胞（RARS）

难治性贫血不伴环形铁粒幼细胞（RA）

难治性血细胞减少伴多系增生异常（RCMD）

难治性贫血伴有原始细胞增多（RAEB）

5q-综合征

不能分类的MDS

急性髓性白血病（AML）

伴有特异性细胞遗传易位的急性髓性白血病

伴有t(8；21)(q22；q22)AML，AML1CBFα/ETO的AML

伴有t(15；17)(q22；q11-12)，PML/RARα及变异的急性早幼粒细胞白血病（APL）

伴有inv(16)(p13；q22)或t(16；16)(p13；q11)，CBFβ/MYH11的骨髓嗜酸粒细胞增多的AML

伴有11q23(MLL)异常增生的AML

伴有多系血细胞增生异常的急性髓系白血病

由MDS转成的

发病前无MDS病史

治疗相关的AML和MDS

与烷化剂相关

与拓扑异构酶Ⅱ抑制剂相关（一些可以是淋巴系）

其他

不能列入类型的AML

未分化AML

未成熟AML

成熟AML

急性粒-单核细胞白血病

急性单核细胞白血病

急性红白血病

急性巨核细胞白血病

急性嗜碱细胞白血病

伴骨髓纤维化的急性全髓增生

急性双表现型白血病

表2-2 WHO淋巴细胞白血病分类的建议

急性前体B母细胞白血病（细胞遗传亚群）

t(9；22)(q34；q11)；BCR/ABL

t(v；11q23)；MLL重排

t(1；19)(q23；p13；PBX/E2A

t(12；21)(p12；q22)；ETV/CBFα

Burkiktt细胞白血病

外周血B细胞白血病

慢性B淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤

前B淋巴细胞白血病

毛细胞白血病

浆细胞白血病

急性前体T母细胞白血病

外周T细胞白血病

前T淋巴细胞白血病（小细胞、脑回状细胞亚型）

T细胞大颗粒性淋巴细胞白血病

侵袭性NK细胞白血病

成人T细胞白血病/淋巴瘤（急性、淋巴瘤性、慢性、冒烟性、霍奇金样亚型）

一、急性白血病

（一）急性非淋巴细胞白血病

急性非淋巴细胞白血病（acute non-lymphocytic leukemia，ANLL）是急性白血病中发病最多的一大类。发病可见于各年龄组，50岁发下成年人多见，男性略多于女性。ANLL大多起病较急，少数患者由骨髓增生异常综合征发展而来，该类病例预后较差。按FAB分型法将ANLL分为M1～M7七种亚型。临床表现以发热、出血、贫血以及脏器浸润引起的症状为主，淋巴结、肝、脾浸润较急淋少见。

1．急性粒细胞白血病未分化型（M1型）急性粒细胞白血病是成年人较常发生一种ANLL，伴有绿色瘤是其临床特征之一，常出现贫血、严重感染和出血症状。

（1）血象：白细胞计数往往增高，亦可正常或减少，血红蛋白以及血小板计数可有不同程度减少。分类中可见原粒细胞，部分患者出现原粒细胞以及残留的成熟中性粒细胞，而未见中间型幼粒细胞，称为“白血病裂孔”现象。

（2）骨髓象：M1型骨髓涂片中原粒细胞显著增生，≥90%（非红系细胞，NEC），早幼粒细胞及以下各阶段粒细胞则少见，＜10%。原粒细胞分化差，形态较均一，核浆比高，胞核大，圆形或卵圆形，染色质呈细沙状，核仁2～5个，小而明显，胞质量少，淡蓝色，部分细胞中可见Auer小体。

2.急性粒细胞白血病部分分化型（M2型）是较M1型稍分化的一种急性粒细胞白血病类型。

（1）血象：白细胞计数高低不一，血红蛋白及血小板往往减少，白细胞增高者分类中易见原粒细胞及幼粒细胞。

（2）骨髓象：按我国的修订标准将M2型又分为M2a和M2b2种亚型。M2型骨髓中原粒细胞＞30%、＜90%（NEC），细胞大小不一，Auer小体较M1型易见。早幼粒细胞及以下阶段细胞＞10%，单核细胞＜20%。部分病例可伴嗜碱粒细胞增多；M2b型骨髓中原粒细胞和早幼粒细胞增多，胞体大小不一，胞核有凹陷，染色质细致，可见大而明显的核仁，1～2个，胞质中度至重度嗜碱，在核凹陷处淡染。形态异常的中性中幼粒细胞明显增生（＞30%），是本型形态学特征，该类细胞有明显核质发育不平衡，核形不规则染色质细致、疏松，核仁明显，胞质量丰富，呈现弥漫橘黄色或嗜碱，可见少量细小中性颗粒。M2b细胞易见Auer小体，其数量仅次于M3型，但未见柴捆状细胞，嗜酸粒细胞明显增多（彩图2-1）

3．急性早幼粒细胞白血病（M3型，acute promyelocytic leukemia，APL） APL是一种特殊类型的白血病，以青状年发病为主，发病率占ANLL的10%～15%以上。严重而广泛出血为其临床特征，患者往往因发生弥散性血管内凝血（DIC）及颅内出血而致死。对化疗反应差，全反式维A酸（ATRA）及三氧化三砷对本病有特效。

（1）血象：大部分病例表现为全血细胞减少，血片中可见少量早幼粒细胞，易被遗漏或误为单核细胞。

（2）骨髓象：骨髓中以颗粒增多的异常早幼粒细胞增生为主，占30%～90%（NEC）。该类细胞胞体不规则，胞核呈类圆形或肾形，可有折叠、凹陷、分叶，染色质粗细不等，核仁常因密集的嗜苯胺蓝颗粒遮盖而不清晰。胞质中含有大量紫红色颗粒，并可见蓝色无颗粒呈伪足状突出，形成“内外质”。Auer小体易见，有时十多条Auer小体呈束状交叉排列，犹如特有的柴捆状，称为“柴捆状细胞”（faggot cell）。根据胞质中颗粒粗细不同，又可将此型分为2种亚型。粗颗粒型（M3a）：胞质中颗粒粗大深染、密集融合常遮于核，核形不清，核仁明显或隐慝（彩图2-2）；细颗粒型（M3b）：胞质中含有多量细小嗜苯胺蓝颗粒，可为灰灰尘样，甚至在光学显微镜下不易见到。染色质细致，核形不规则或肾形。形态上易误诊为单核细胞白血病，需结合细胞化学染色及染色体检查加以鉴别。

4．急性粒-单核细胞白血病（M4型，acute myelomonocytic leukemia，AMMoL） AMMoL的特征是粒细胞系和单核细胞系同时增生的一种急性白血病。临床和实验室检查亦兼有这两系白血病的特征。

（1）血象：白细胞计数高低不一，血红蛋白和血小板可有不同程度减少。分类易见白血病细胞，部分患者易见单核细胞和（或）嗜酸粒细胞。

（2）骨髓象：有核细胞增生明显至极度活跃。白血病细胞形态变异较大，根据粒、单核两系细胞增生程度的不同可分为4种亚型。M4a型：骨髓中以原粒及早幼粒细胞增生为主，原、幼单核细胞和单核细胞＞20%（NEC）；M4b型：骨髓中以原、幼单核细胞增生为主，原粒和早幼粒细胞＞20%（NEC）；M4c型：原始细胞既具有粒系又具有单核系特征者≥30%（NEC）；M4Eo型：除兼有上述特点外，嗜酸粒细胞占5%～30%，甚至更多，胞浆中嗜酸颗粒粗大而圆，着色较深，并伴有较多颗粒粗大而不规则的嗜碱颗粒与嗜酸颗粒混和相间。

5．急性单核细胞白血病（M5型，acute monocytic leukemia，AMoL） AMoL多见于成年人，尤其老年患者。临床上髓外浸润较明显，尤其齿龈、皮肤以及中枢神经系统受累更为突出。由于此型白血病易伴高溶菌酶血症和溶菌酶尿症，患者有发生肾功能衰竭的倾向。

（1）血象：白细胞计数大多增高，也可减低。血红蛋白和血小板减少，分类中易见原、幼单核细胞。

（2）骨髓象：有核细胞增生明显至极度活跃。根据单核细胞分化程度不同又可分为2种亚型：M5a型（未分化型）。原单核细胞显著增生，≥80%（NEC），幼单核细胞较少。原单核细胞分化差，胞体大而不规则，胞核呈多形性，表面有起伏感，常见凹陷或折叠，核染色质疏松呈细网状，核仁明显。胞质蓝灰色，可有伪足突出，浆内可见空泡，细胞中Auer小体呈细长形。M5b型（部分分化型）。白血病细胞为分化不一的单核细胞，其中原单核细胞＜80%（NEC）、幼单核细胞明显增多。该类细胞大小不一，外形不规则，胞核折叠呈笔架形、肾形等，染色质条索或网状，胞质丰富，蓝灰色，可有嗜苯胺蓝颗粒（彩图2-3）。

6．红白血病（M6型，erythro leukemia）红白血病是一种由红细胞系和白细胞系同时恶性增殖的疾病，随病情进展可转变为急性粒细胞系或单核细胞系白血病。

（1）血象：多数患者表现为全血细胞减少，血红蛋白轻～中度减少，血小板常显著降低。分类中白血病细胞多少不一，幼红细胞易见。

（2）骨髓象：骨髓有核细胞多明显增生，粒红比倒置。红细胞系显著增生，占有核细胞50%以上，幼红细胞伴有畸形及病态发育，可见巨幼样变、核碎裂、双核、多核、巨形核、母子核等异常形态。在红细胞系改变的同时伴有白细胞系的异常增生，原粒或原幼单核细胞往往＞30%（NEC）。

7．急性巨核细胞白血病（M7型，acute megakaryocytic leukemia，AMKL） AMKL是一种特殊类型的白血病，发病年龄多见幼儿及青状年。过去少见，原因是单用光镜和常规细胞化学染色难以确诊，20世纪70年代后随电镜、电镜血小板过氧化物酶（PPO）及抗血小板糖蛋白的单抗的应用，可以明确此型的原始细胞属于巨核系，证实本病并非少见。AMKL病情凶险，对化疗不敏感，预后不良。

（1）血象：常为全血细胞减少，分类中原始细胞多少不一，可见小巨核细胞。伴有骨髓纤维化者血片中易见幼粒、幼红细胞及巨核细胞碎片。

（2）骨髓象：部分患者骨髓穿刺时干抽是本病的特点之一。骨髓有核细胞增生明显至极度活跃，亦可增生低下。原巨核细胞明显增生，占30%以上。该类细胞大小不，多形性明显，核圆形，染色质疏密不一，可见1～3个明显或隐慝之核仁。胞质量少，色蓝，可有颗粒，有管泡状、芽状、瘤状、龟状等突起。

（二）急性淋巴细胞白血病

急性淋巴细胞白血病（，ALL）是原始及幼稚淋巴细胞在造血组织中恶性增殖的疾病。本病好发于儿童和青壮年人，占儿童白血病的60%～70%，而占成人白血病的10%以下。临床上以淋巴结、肝脾肿大最为明显，常伴有骨、关节疼痛，中枢神经系统浸润亦常见。ALL患者对化疗较敏感，目前儿童急淋的完全缓解率（CR）已达95%以上，5年无病生存率达50%～75%，成人ALL-CR率在75%以上，5年无病生存率可达50%。骨髓移植治疗和造血生长因子的应用进一步提高了患者的生存率和根治率。

1．血象：绝大多数患者初发时白细胞总数增高，往往高于（50～100）×10⁹/L，分类亦以原始和幼稚淋巴为主，涂片末梢区域易见涂抹细胞。约1/3病例白细胞总数正常或偏低。血红蛋白和血小板计数早期呈轻度至中度减少，少数病例正常。

2．骨髓象：骨髓有核细胞增生为极度或明显活跃，增生低下少见。分类以原始及幼稚淋巴细胞为主，占30%～90%。涂抹细胞易见。粒、红、巨三系细胞明显减少。根据白血病细胞不同的形态特点，又可分为3型：L1型，原始和幼稚淋巴细胞以小细胞为主，直径约12μm，核圆形，偶有凹陷、折叠，染色质较粗，结构较一致，核仁小而隐慝，胞质量少，呈轻或中度嗜碱。L2型，原始和幼稚淋巴细胞大小不一，以大细胞为主，直径大多＞12μm，核形不规则，常见凹陷及折叠，染色质较疏松，结构较不一致，核仁清晰，一个或多个，胞质量常较多，有些细胞深染（彩图2-4）。L3型，原始和幼稚淋巴细胞大小较一致，以大细胞为主，核形较规则，染色质呈均匀细点状，核仁明显，一个或多个，呈小泡状，胞质量较丰富，深蓝色，空泡明显，呈蜂窝状，形似B淋巴瘤细胞。国外有学者认为可将L1与L2再分为L1/L2型（以小原、幼稚淋巴细胞为主，大原淋巴细胞占11%～25%）、L2/L1型（大原淋巴细胞占25%～50%）及L2/L2型（以大原、幼稚淋巴细胞为主，占50%以上）。中国一般可规定大原淋巴细胞≤25%时为L1型，大原、幼稚淋巴细胞占25%以上时为L2型。

第四节骨髓病理技术

一、骨髓涂片和切片

骨髓的形态学包括组织学和细胞学，习惯上把细胞学检查等同于涂片检查，组织学检查等同于骨髓活检，但是，骨髓吸取中的骨髓小粒具有组织学的表现，同样可以作为包埋切片，Rylwin的专著即以此法为主，活检和吸取只代表取材方法不同，涂片和切片则为材料处理不同，相互交叉而有四种结果，它们各有所长，亦各有不足，应互补短长。表2-3列举了各种疾病最佳采用的方法。

表2-3 各种疾病最佳采用的方法

疾病	涂片	印片	小粒石蜡包埋	低温塑料包埋
贫血	+		+
急性白血病	+		+
MDS	+			+
MPD（干抽）		+		+
毛细胞白血病	+			+
恶性淋巴瘤（累及骨髓）	+		+	+
浆细胞疾患	+			+

骨髓涂片中细胞平铺而较大，结构清晰，传统的Romanowsky染色后，色泽对比好，而且累积了70余年经验，决非其他方法可替代，但细胞分布空间结构的丧失为其不足之处。

活检印片是在保留涂片优点的基础上，可约略显示细胞的空间分布，但每个活检标本只能做到3～4张印片。

骨髓吸取材料中检出骨髓小粒，进行包埋切片（不需要经过脱钙处理）可观察组织学结构，在这种切片可作较多的免疫标记，特殊染色（网状纤维和胶原纤维染色），方法与其他组织相同，铁染色结果稳定可靠，其不足之处是所得材料较少，与骨小梁的关系不够明确。

骨髓活检可经过脱钙后，用石蜡包埋或不脱钙用塑料包埋，前者因脱钙液的作用影响酶活性，抗原性和其他染色特性（特别是铁的估计失实），后者可用一般塑料或低温塑料（低温塑料可保留酶的活性和抗原性）是一种较好的方法，但需高功力的切片机和钨钢刀。

骨髓涂片和切片在观察和思考解释上的差异：骨髓涂片主要观察单个细胞的结构和染色，着重在细胞核的结构，胞浆的染色和内含物，这方面信息的细微程度是切片所难以比拟的，但由于血膜制作过程中的人为因素丧失了细胞之间以及细胞与胞质（血窦和骨小梁）之间的关系。骨髓切片中保留了细胞与间质的空间定位，通过电脑组成的三维空间结构图像，更真实的反映实际情况。

观察涂片中各种细胞，习惯上应用计数100个有核细胞，分列其百分数，以其百分数作为诊断标准。在切片中一般不作计数，仅用目测估计或图像分析粒红比值、细胞与脂肪的比值，为此，切片中尚无一个量化的标准，而主观成分较多。

病理学家观察外周血涂片与血液学家亦有不同，前者用估计法。

血小板和白细胞的数量：

血小板：＞25个/油镜视野增多

＜1个/油镜视野减少

白细胞：2～4个/高倍视野（4.0～7.0）×10⁹/L

4～6个/高倍视野（7.0～10.0）×10⁹/L

6～10个/高倍视野（10.0～13.0）×10⁹/L

10～20个/高倍视野（13.0～18.0）×10⁹/L

二、骨髓活检标本制备

（一）切片制作

取得的骨髓活检标本，必须立即固定，切忌干燥，干燥会影响细胞形态及染色。

1．固定作一般HE染色，网状纤维和胶原纤维染色，可用4%甲醛水溶液，由于甲醛易氧化成甲酸而影响溶液的酸碱度，因此用磷酸缓冲甲醛溶液较好，固定时间为12～24小时。

做酶的组织化学时，用4℃冷丙酮固定，固定时间为4小时，以后直接浸入浸透液作塑料包埋，这样可以保留酸、碱性磷酸酶和非特异性酯酶。过氧化物酶和氯醋酸酶在甲醛固定的标本中仍可显出。

B-5固定液被认为是造血组织的最佳固定液，但因需用Hg₂Cl₂（有毒），不适用于一般实验室，可用相同量的ZnCl₂代替，效果相同，还可免去切片染色前的去汞，比较方便。

注意固定的容器必须干净，同时不能用铁质的瓶盖，由于铁屑沉积于组织会造成（铁）假阳性反应。

2．脱钙组织在石蜡包埋之前须先脱钙，脱钙以用甲酸和甲醛混合液最为恰当，由于它不易造成过度脱钙，影响染色，而造成诊断固难，脱钙时间为12～24小时，以后再用巴比妥钠溶液浸泡，可纠正脱钙对染色的影响。

文献上介绍用EDTA脱钙，它对酶的组织化学，免疫组织化学，以及原位杂交的影响较小，但EDTA使组织变硬，影响切片。

注意任何脱钙液在脱钙的同时均溶解铁盐，因此在脱钙的标本中，进行铁含量的估计是不可靠的。估计铁含量对某些疾病的诊断是关键的，这时必需用骨髓小粒，不经脱钙的石蜡切片，也可用塑料包埋，才有价值。

3．固定脱钙同时进行，用醋酸-Zenker溶液可以兼固定和脱钙。

4．脱水和透明脱水宜从50%乙醇开始，一般以不加温为好，这样细胞收缩较少，脱水过程宜慢，由于组织小，时间也不会太长，二甲苯浸透的时间不能过长，否则使组织变脆，对切片及染色均有影响。用苯透明可以避免组织变脆。

5．浸蜡及包埋包埋石蜡宜用融点较高（62℃）的硬蜡。

6．切片及贴片切片厚度以3～5μm为好，薄的切片有利于观察细胞的细微结构，但做网状纤维染色时，切片不宜太薄，以5～10μm为好，在不能获得连续切片时，可将切去封面石蜡的蜡块，置于白猫洗洁精中浸泡几个小时，使胶原软化，有利于蜡条的连续。

玻片上一般不涂粘合剂，否则会使前景同时着色，但在做免疫组织化学时，特别在用酶消化增强反应时，须要用粘着剂。

在1张玻片上应粘贴连续的5～6条组织的蜡条。

7．烘片在60℃至少烘1小时。

（二）染色

1．苏木精-伊红（HE）染色任何一种苏木精的配方均可应用，但以进行性染色者较好。苏木精染色宜淡，才能显示出核的细微结构。伊红染色就更淡，只要能与背景区分即可，切忌染色过深。为此有必要与其他组织分开染色。

2．甲基绿-派洛宁（MGP）染色对免疫母细胞和浆细胞的识别，MGP具有价值，但脱钙对MGP染色有一定的影响，因酸会使DNA变性（双链分离）而影响与甲绿的结合，调节甲绿的浓度，可得适当的纠正。

3．网状纤维染色任何一种网状纤维的镀银方法所得到的结果基本相同，各实验室可按常规方法进行，即使半定量的分析也不会因方法差异而影响结果的比较。

4．胶原纤维染色常用的方法是Van Gieson和Masson三色染色（用亮绿染胶原纤维），Van Gieson法较好。因为Masson法在用磷钨酸“脱色”时须镜下控制，但Van Gieson法的切片保留时间短，复红易褪色，Van Gieson法的细胞核染色须用铁苏木精，须用前配制，费时间，又费试剂是它的缺点。

5．铁染色（P法）此为经典的显示铁的方法，简单可靠，但须注意的是试剂必须用前配制，染色后即弃去，不能反复应用，否则会影响染色；另一点须注意的是，在操作时不能使金属镊子直接接触溶液，可涂石蜡或用塑料套以隔离金属与反应液的接触。

第五节骨髓病理学在白血病分型中的应用

白血病主要病变器官是骨髓，但骨髓组织病理在白血病的诊断中不占主要地位。骨髓细胞学检查是诊断白血病的主要手段。也是诊断白血病“金”标准的依据。骨髓组织学检查的材料可取自吸取标本中的骨髓小粒或骨髓活检，前者不需脱钙，即可脱水包埋，可以保存较多的抗原性。后者需要脱钙后，才能石蜡包埋，如不脱钙则需要塑料包埋。三种处理对以后的染色（包括酶标）的影响不同，而结果也会有差异。

骨髓组织学检查对白血病的诊断意义不大，但它所提供的一些信息，对治疗及预后有一定的关系。在骨髓“干抽”时，骨髓活检“晋升”为诊断的主要“角色”。这时，这就有必要在切片上进行一定的细胞化学和免疫细胞化学染色，才能作出诊断，单独HE染色切片，其可信度是有限的。临床医师必须注意这一点，切勿轻信仅凭HE切片所作出的诊断。

一、急性白血病

急性白血病骨髓中细胞增生程度的估计，在取材好的标本（即标本完整有一定的体积，宽度在0.2㎝，长度不少于1.0㎝；并且取自一定的深度）中的估计的可信度较涂片高。

急性白血病骨髓中白血病细胞的荷载及背景：经典急性白血病组织学图像中正常骨髓组织消失，整个骨髓腔中几乎全被白血病细胞占据，结构脂肪可全部消失，或残存几个脂肪空泡。白血病细胞为前体细胞，细胞体积大，细胞与细胞之间边界模糊，细胞核大，染色质细，有1-2个体积较大的核仁，细胞浆为嗜碱性染色。细胞呈同龄化，没有分化现象。嗜酸性细胞和巨核细胞消失，此种图像多数见于初发白血病伴外周白细胞增多的病例。另一种图像称为混杂浸润，正常造血成分的背景仍能分辨，可见到嗜酸性细胞、分叶核和带状核粒细胞，以及幼红细胞（成岛状集结）。但多数情况下巨核细胞缺如。在此背景上有不同大小结节状或成片的白血病细胞。此种图像多见于早期白血病或冒烟型白血病，或由MDS转变而来的白血病。还有一种图像似再生障碍性贫血的骨髓象。骨髓腔中细胞成分少，结构脂肪占绝大部分，在结构脂肪的间隙中可见到造血成分，其中主要是幼稚细胞。此种图像出现在由再障或低增生性MDS转化而来的急性白血病。

急性白血病的类型在HE染色的骨髓组织切片中不能鉴别。这是因为HE染色的切片，不能区别原粒、原淋和原单，即使原红亦不能区别。为此严重的巨幼红性贫血的骨髓组织学图像与急性白血病有极易混淆，如骨髓病理诊断为急性白血病，而涂片为巨幼红细胞增多，那肯定是切片的误诊。

急性白血病骨髓中网状纤维一般不增加，没有胶原纤维形成。出血、坏死极为罕见。但血窦可有扩张，扩张血窦中幼稚细胞的数量与外周血象中白细胞的数量没有肯定的关系。

急性骨髓纤维化可以认为与全髓细胞性白血病是同一个疾病的2个方面观察结果而应用的2个名称。急性骨髓纤维化的诊断依据尚未有统一认识，因此，单独病理组织学不应用急性骨髓纤维化的诊断。但是，没有病理的描述，急性骨髓纤维化的诊断也不能成立。

组织病理学有时用冒烟型白血病的诊断名称。这是指临床及血液学图像均不够白血病的诊断标准，但在骨髓切片中有成团或成片的幼稚细胞分散在正常造血的背景上，这种幼稚细胞体积大，核亦大，细胞有异型性。易被误诊为转移性恶性肿瘤。因此，对这种病例首先必须确认这些细胞的性质（可先用MAC387在一般石蜡切片上进行免疫细胞化学染色确定为粒系细胞；并用CD20、CD45RO排除淋巴系，EMA、细胞角质、CEA及AFP排除转移性癌及S-100排除恶性黑色素瘤；最主要的是用UEA排除巨幼红性贫血），才可考虑诊断。在无标记情况下的诊断。只能作为倾向性意见，而非肯定诊断，是不能作为治疗依据的。

急性白血病化疗后的骨髓变化，在最初几个小时，原来高度细胞性的骨髓迅速变成完全缺乏造血成分的“再障样”骨髓。这是化疗最有效的表现，骨髓中仅留下一个网状支架轮廓。以后正常造血成分逐渐出现，生成过程中，三系细胞各自形成一个个小岛。三系细胞出现有先后，一般粒系最早出现，其次为红系，巨核系最晚。巨核系一般需在3周后才出现。化疗后骨髓活检的观察需要注意巨核系的恢复情况。

急性白血病化疗后对缓解程度的估计，活检的可靠程度大于涂片，笔者曾遇到5例涂片显示完全缓解，但切片中仍有大片白血病细胞。随访很快复发。因此，在化疗后复查骨髓是同时作活检是很有必要的。

二、慢性白血病

（一）慢性粒细胞性白血病

慢性粒细胞白血病骨髓组织学检查需着重描述：①细胞量：即细胞与脂肪的比例，用百分率表示，以10%为1个递增单位。②慢粒图像：指在小梁旁和血管周围明显的早幼粒白细胞和中幼粒细胞的聚集。这种慢粒图像逐渐演变成弥漫性。以无、灶性或弥漫性表示。③粒/红比例：以1/10作为递增单位；粒细胞的核碎片和蜡样巨噬细胞（假戈谢细胞）：在2个高倍视野中见到为“少量”、在每个高倍镜视野均能见到为“存在”和“未见到”3种描述标准。④红系生成情况。正常、左移（原红及早幼红细胞增多）和红系病态造血（包括红系细胞巢中细胞发育停顿在同一阶段；红系细胞巢沿骨小梁；双核红系细胞；核碎片和核分裂相增多）。⑤巨核细胞数量。计算10个不连接的高倍镜视野下的巨核细胞数，以每个高倍镜视野的平均值报告。⑥小巨核细胞。指单个、圆形或稍有切迹细胞核，围绕极少胞浆的巨核细胞（计数方法同前）。⑦终末巨核细胞数。指染色质深和结紧的核，无明显胞浆的巨核细胞（计数方法同前）。⑧巨核细胞巢。指3个以上巨核细胞簇，以有或无表示。⑨纤维化。指网状和胶原纤维，按0-4级表示。⑩异常脂肪组织。指显著大小不一的脂肪细胞聚集。以存在或无表示。上述各种变化在慢性粒细胞性白血病的各个病例的不同阶段均有差异。其细胞数以90%为临界点，＞90%为高危，完全缓解率低，＜90%者半数可获缓解。粒/红比以9为临界点，＞9为高危。

1．慢性粒细胞性白血病用干扰素治疗后的组织学变化 ①细胞数的减少，可减至70%～80%；②慢粒图像可消失，或由弥漫变成灶性；③粒/红比例的减低，可减至5左右；④终末巨核细胞数增加，由＜1增加到1～2个；⑤纤维组织增加；⑥异常脂肪组织的出现。

2．慢粒急变慢粒急变的组织学的指标是骨髓内母细胞的数量，在涂片中以30%为临界点，但在骨髓活检中，以超过20%为“母细胞增多”；超过70%才称为“母细胞危象”。

3．慢粒中的细胞凋亡慢粒中的细胞凋亡的平均值为13.2±5.4(正常骨髓为7.0±2.3)。在药物治疗后，用干扰素者，凋亡数量至28.3±3.1。但在用B治疗者，变化不大。凋亡数还可作为独立的预后指标，以15为临界值，≤15.0者预后好，中位生存期为77个月，而＞15者，中位生存期仅32个月。

4．慢粒与类白血病的鉴别诊断慢粒与类白血病反应在骨髓活检中没有区别的“金标准”。但下列3个指标可以给予倾向性的意见。在类白血病反应中，多数有肥大细胞的增多（平均70个/10㎜²，正常为20个/10㎜²），慢粒时减少（平均1个/10㎜²）。类白血病反应中极少有假戈谢细胞，因此有明显假戈谢细胞者，倾向于慢粒。还有含铁的巨噬细胞数量在类白血病时增多（平均130个/㎜²，正常55个/㎜²）而慢粒中多数减少（平均16个/㎜²）。

5．慢粒伴纤维化慢粒伴纤维化的比例各家报道不一，6%～22%。慢粒中出现纤维化的意义，各家意见亦不一致，有认为治疗后可以消退，有认为是急变的前期现象，有认为较少发生急变。

慢粒中巨核细胞变化是慢粒活检中重要观察对象之一。巨核细胞数量正常颧减少，体积偏小者，定为普通型。巨核细胞体积增大，数量增多者，定为巨核细胞增多型。

（二）慢性淋巴细胞白血病

慢性淋巴细胞性白血病与小淋巴细胞性淋巴瘤是否同一疾病尚有不同看法，但单独骨髓活检中两者的表现可完全一样，慢淋早期骨髓中的白血病细胞分布图像可为间质性或结节性。而淋巴瘤累及骨髓的后期同样可呈弥漫性的图像。

慢性淋巴细胞性白血病极盛期的骨髓组织学变化表现为造血成分明显增生，脂肪组织明显减少到消失。细胞均一，酷似小淋巴细胞，可有少量中等体积或大细胞。

慢淋早期的间质性浸润极难与非肿瘤性的反应性增生相区别。

慢淋的结节性浸润图像亦须与良性反应性的淋巴细胞集结鉴别，表2-4可作为参考。

表2-4 良性反应性的淋巴细胞集结与慢性骨髓病理鉴别

	良性增生	恶性增生
结节与周围组织分界	明显	模糊
细胞类型	多型性	单一性
血管	增多	不增多
网状纤维	车轮状	杂乱
生发中心	可有	无

但上述现象均非鉴别的“金标准”，临床医师需根据病理描述，作出倾向性“诊断”。

如果瘤细胞的浸润位于小梁旁的特定部位，则可以认为是中心细胞性淋巴瘤，此种小梁旁的图像为滤泡性淋巴瘤所独有，可以排除经典的慢性淋巴细胞性白血病。

脾脏原发性淋巴瘤早期累及骨髓，并常伴白血病，以往称为“变异型慢性淋巴细胞性白血病”。当骨髓内白血病细胞主要局限有血窦内时，则高度提示为脾性淋巴瘤伴白血病。

三、多毛细胞性白血病

多毛细胞性白血病的诊断“金标准”是透射电镜。以往认为抗酒石酸酸性磷酸酶具有诊断价值。目前认为并不特异。而CD103是鉴别多毛细胞白血病和其他B细胞白血病的最有用的方法。DAB₄₄也有帮助，但可靠性不及CD103。

多毛细胞白血病的骨髓组织学可表现为3种类型：①弥漫型；②局灶型；③间质型。间质型表现为低细胞性的脂肪细胞之间，散在白血病细胞，可被误认为再障。

多毛细胞白血病在切片中不显示多毛的形态。但在细胞之间有网状纤维。多毛细胞诱导纤维母细胞产生网状纤维，称为“细胞间网状纤维化”，与红细胞外溢形成的“血湖”同为多毛细胞白血病的的特征性组织学变化。

四、大颗粒淋巴细胞白血病

CD56+为其主要特性。骨髓浸润稀少，仅轻度或中度淋巴细胞增多。灶性浸润者不多。可表现为粒系成熟停顿和红系再生低下。单独骨髓活检对诊断意义不大。

五、慢性骨髓增生性疾患

按照WHO分类，慢性骨髓增生性疾患（CMPD）包括：①真性红细胞增多症（PV）；②原发性血小板增多症（IT）；③慢性粒细胞白血病（CML）；④原因不明髓样化生（AMM）。这4个疾病的组织学变化有重叠，因此在做诊断时必须联系了往病史、血象、骨髓象等，骨髓活检的图像只代表连续过程中一瞬间的变化。

（一）真性红细胞增多症

1．组织学变化红系生成增生明显，粒系及巨核系（可达40个/㎜²）也有生成增加，三系细胞的位置一般没有改变。血窦增生（平均达7%），脂肪组织减少，铁储备显著减少（96%无铁测得）。可伴有不同程度的纤维化。

2．亚型

（1）红、巨型：粒系无明显增加，红系及巨核系细胞出现在邻近骨小梁区域。

（2）红、粒型：巨核细胞数量正常，红系及粒系前体细胞数量增多。

（3）红系型：仅红系增生。

3．诊断真红的诊断依据主要是血容量及外周红细胞数量，组织学检查作为常规。如组织学不典型或红细胞数量在（5.0～6.5）×10¹²/L，则诊断为交界性真红（polyeythaemia vera borderline）。

4．鉴别诊断

（1）AMM：在第一期（细胞性）时，同样表现为三系增生，但根据临床病史及实验室检查，可以鉴别。在活检中，骨髓内巨噬细胞浆内铁一般仍为正常。

（2）继发性红细胞增多症：根据临床病史不难排除，在活检中主要区别是铁反应，继发性铁储备无变化。

5．活检提供信息

（1）有无纤维化。

（2）残留脂肪量（＜5%、＞5% ）。

（3）浆细胞数量。

（二）原发性血小板增多症

1．组织学骨髓内造血成分多数呈增生，但也有正常或减少者。但巨核细胞绝对值肯定增加。巨核细胞成簇存在，细胞多样性，体积可小或巨大，可见到固缩的细胞。

2．亚型

（1）巨核细胞骨髓病（成熟型）：特点为骨小梁正常或轻度减少。造血成分与脂肪比例正常，血窦扩张、增生。红系及粒系轻度增加。常形成簇，其邻近的血窦中常有成堆血小板，没有异常的巨核细胞。

巨核细胞数量和血窦增生程度与外周血小板总数呈正相关。

（2）巨核细胞骨髓病（未成熟型中的第一类）：此型组织学表现为出现异常的巨核细胞，体积小，多样性，成片存在。并常伸展到骨小梁表面。此型周围血象多数（3/4）为血小板减少，其余15%血小板正常，仅10%表现为血小板增多。

3．诊断诊断依据为血小板超过700×10⁹/L，并排除继发性，骨髓活检中巨核细胞数量的估计较涂片精确，但并不作为诊断依据。值得注意的是外周血中血小板超过1M/L，但可有骨髓中无显著增多，也没有巨大的巨核细胞的情况。这种情况多见于反应性。

4．鉴别诊断

（1）继发性血小板增多：除临床病史外，骨髓活检中可以作为参考的变化是：没有成簇的巨核细胞。也没有多形性或固缩型的巨核细胞。

（2）慢粒：慢粒可伴血小板增多，临床血象可以鉴别。在活检中粒系增生程度明显高于巨核系增生程度。

5．纤维化有无及程度；

（1）纤维化有无及程度；

（2）脂肪组织残留量＜5%、＞5% 。

（三）慢性粒细胞性白血病

1．组织学通常表现为充填型骨髓图像，几乎没有脂肪细胞可以见到。粒系细胞增生，细胞分化成熟，在骨小梁及血管周围有袖套样聚集，在骨髓中央区可见到未成熟细胞，另一种情况为在小梁旁区有原粒和早幼粒，在中央区突然变为成熟粒细胞。巨噬细胞内可见到晶样包涵体，有不等数量的浆细胞、肥大细胞和淋巴细胞，血管增多，血管周围网状纤维可呈中等度增加。

2．变异型及亚型

（1）慢性巨核细胞性粒细胞性白血病（CMGM）：巨核细胞的质和量上改变，高度异形，并有位置异常。巨核细胞单个或成簇，并可出现在血窦中，在邻近巨核细胞簇和动脉部位常有不等量纤维增生。

（2）嗜酸性和嗜碱性亚型：HE染色不能识别。

3．诊断慢粒的诊断依据为：外周血细胞＞30×10⁹/L，典型的血涂片，脾大及排除继发性白细胞增多，骨髓活检只有在干抽时才有价值，须注意在此种情况下往往须作AKP积分，因此活检须用丙酮固定，塑料包埋。

4．鉴别诊断

（1）类白血病反应：单凭骨髓活检图像极难鉴别。可作为参考的表现是类白反应细胞致密程度较差，胞浆内有晶体样包涵本的巨噬细胞少，血管周围浆细胞增多现象较为显著。

（2）反应性嗜酸性细胞增多症：骨髓活检中与嗜酸性白血病极难鉴别。

（3）AMM：慢粒伴骨髓纤维化时，与AMM鉴别困难，需要结合病史，体征及周围血象综合考虑。

（四）原因不明髓样化生（AMM）

此名称指一个连续性的病理过程，开始于骨髓细胞（三系）增生，伴轻度纤维化，发展到骨髓全部被致密纤维组织替代。它与描述性的纤维组织增生不同，虽然目前认为两者中的纤维组织均为多克隆性，但原发性骨髓纤维化的病因不明，而后者常出现于淋巴增生性疾患、霍奇金病、转移性癌、原发性副甲状腺功能亢进和硬化性骨髓炎（创伤和毒物引起）。

1．组织学分为3期，但3个时相可有重叠。

（1）细胞期：表现为三系细胞增生，三系细胞的比例在各个病例可不一样，最常见的是巨核细胞增生，伴体积巨大的细胞。此期虽有轻度的网状纤维增加但无显著纤维化，此期与真红的组织学图像不能鉴别，最主要的区别是髓外造血为本病的主要特点。

（2）第二期为骨髓增生区和纤维化区域镶嵌混杂，纤维成分为网状纤维和胶原纤维。脂肪细胞减少，红系及粒系成分减少，巨核细胞显得突出。

（3）骨髓纤维化及骨髓硬化：虽然细胞增生可持续到此期，但除巨核细胞外，其他成分往往减少，巨核细胞成簇在实质或血窦中。骨硬化性骨小梁可超过30%骨髓腔，其特征是这种小梁中不衬着成骨细胞。骨质为粗纤维骨呈双折光，病变首先开始于扁骨，以后以展到长骨。

2．诊断骨髓纤维化的名称既可以作为一种疾病，也可以作为病理形态的描写，因此每一个医院的病理科必须与血液科达成一项默契，以资鉴别。如以AMM表示疾病，骨髓纤维化作为描述性用语，或以骨髓纤维化作为疾病名称而以Desmoid反应作为描述性用词。

3．鉴别诊断

（1）细胞期应与真红、原发性血小板增多症和慢粒鉴别：AMM与真红鉴别可作铁染色；AMM与慢粒鉴别可作AKPase积分。

（2）纤维化期应与骨髓的Desmoid反应相鉴别，在没有找到可靠的其他变化时，以描述性报告较为妥当。

（3）AMM晚期骨髓全部纤维化，偶尔有血窦扩张及出现脂肪细胞，须注意勿误诊为再障。

（4）母细胞危象：大多数慢粒病人在进入终末期时，出现抗拒化疗现象，此种转变可很突然，骨髓表现为母细胞浸润，与急性白血病不能区别。但多数为逐渐变化，包括骨髓进行性增生加速，伴未成熟细胞增多和成簇。多数未成熟细胞为原粒，但也有具有TdT阳性的母细胞，属“淋巴样”母细胞危象，也有可谓原红母细胞危象（erythroblastic blast crisis），活检中可见到条纹状母细胞浸润，类似红白血病表现。

六、骨髓增生异常综合征

根据1997年WHO建议的分类，MDS分为：①难治性贫血：伴环铁粒母细胞和不伴环铁粒母细胞；②难治性全血细胞减少伴多系细胞间变（RCMD）；③难治性贫血伴母细胞增多（RAEB）；④5q-综合征；⑤不能分类。

会议中未取得一致意见的骨髓间变/骨髓增生病（myelodysplasic /myeloproliferative disease）这个名称是否应用。所谓MDS/MPD包括：慢性粒单细胞白血病、不典型慢性粒细胞性白血病及青年型粒单细胞白血病。血液学家将它归入慢性骨髓增生性疾患。而病理学家则认为需另列一类。

不管是传统的还是新建议的分类，MDS的诊断立足于骨髓细胞学检查，骨髓组织学检查的结果只作为参考，其中的某些表现与预后有一定的关系，但并不是诊断依据。

（一）MDS的组织学变化中有3个图像

1．同期原红细胞岛红细胞的发育在骨髓中以红细胞岛为基地，围绕一个含铁的巨噬细胞，层层围绕，愈向外愈成熟，岛中细胞为不同成熟阶段。这种岛内细胞为同期的现象，说明成熟障碍。

2．异位的未成熟前体细胞未成熟前体细胞泛指幼稚的粒系细胞。粒细胞的发育过程，起始于内膜，愈中央愈成熟，一般在骨小梁之间的中央区中，没有幼稚细胞，有3、5个细胞形成簇的现象，称为ALIP（abnormal localization of immature precursor）。但在切片中，需要在全片中找到3个以上的“簇”，才能认为是ALIP。

3．小巨核细胞究竟小到什么程度，才算“小”，尚无一致的标准。有的认为单个核的即算小，有的认为形态上与原始细胞无区别，需标记才能决定是巨核系的才是小巨核细胞。

（二）MDS的组织学图像有几种不同的分类

1．按照细胞数量及各系的表现分类（表2-5）

表2-5 按细胞数量及各系的表现分类

	Ⅰ型	Ⅱ型	Ⅲ型
细胞数	＞或＜50%	＞50%	＞50%
红系	增生、异常	增生	减少
粒系	正常	正常或减少	增生
ALIP	无	有	明显
巨核系	形态异常	形态异常	多见
发展成白血病	1/12	4/11	5/17
生存	5/12	0	11/17
死亡	6/12	7/11	11/17
平均生存（月）	30	15	17

2．另一种分类如下

（1）铁粒细胞型：表现为基质细胞增多，有铁粒幼细胞（环形铁粒细胞或非环铁粒细胞）。

（2）巨幼样改变型：表现为红系及粒系幼稚细胞的巨幼样改变。

（3）增生型：表现为细胞数量增多，粒系细胞数量增多，有不典型的巨核细胞，并有网状纤维多。

（4）母细胞型：细胞数量增多可减少，未成熟细胞增多。

（5）炎症型：表现为明显的炎症反应，造血细胞减少，间质发生浆液性萎缩，纤维化，有淋巴细胞、浆细胞和肥大细胞浸润。

（6）低增生型：表现为造血成分减少。原红细胞岛大小不一，有成熟停顿。粒系生成减少。巨核细胞形态正常，数量减少。

骨髓组织学检查在MDS中不作为诊断依据。ALIP虽然被认为是MDS的特征性变化，但在常规染色中，它与巨幼样变的红系细胞簇不能区别。为此，没有涂片的帮助，单独切片的MDS诊断是不能成立的。然而，在MDS中单独ALIP这个指标，对预后是有帮助的。在40例分析中，ALIP阴性者12例，平均生存期为33个月，发展成急性白血病的1例（8%），感染出血死亡的5例（42%），存活的6例（50%）。找到ALIP的28例，平均生存仅16个月，40%发展成急性白血病（11例），半数（14例）死于出血和感染。仅10%（3例）存活。

目前认为MDS是高增殖和高凋亡的状态，其高凋亡是代偿性适应，作为保护机体的措施仅是学术上的假设。但在实际临床上，检测凋亡指数对在发展成白血病的阶段上可作考虑。将＜15%作为低凋亡率，3%-75%作为中等，＞76%作为高凋亡率。MDS均为高凋亡率，若凋亡率逐渐减低，表示在进展成急性白血病。

第二章完

2003年8月7日星期四

第四章

白血病免疫学

第一节白血病细胞的抗原及相应抗体

白血病细胞的免疫学检查主要是检测白血病细胞的免疫表型。即用特异的抗体检测白细胞的核、浆或膜上的抗原。是MIC分类中不可缺少的一部分。白血病细胞的抗原可以分为两类：一类是正常细胞系所具有的抗原，它在正常细胞分化发育过程中出现或消失；另一类是与细胞功能状态有关的抗原。还有少数特殊的肿瘤性质的抗原。

一、血细胞的种系和分化抗原

在临床应用中较普遍的有：

（一）幼稚细胞

1 HLA-DR 抗原属于组织亲和性复合物Ⅱ。单抗来自不同的克隆而有不同的名称：如Q5/13、LN3、TAL.1B5(α)、DK22（β）。亦称为Ia。出现在多能干细胞最初分化阶段的B系淋巴细胞和髓系细胞，正常T系淋巴细胞不表达（但激活的T细胞可表达）。此种单抗可用于福尔马林固定的组织，一般不需要作抗原修复（但DK22仅能用于涂片）。

2 末端脱氧核苷转换酶（TDT）单抗来自克隆HT-1、3、4、6。抗原存在于前体T和B淋巴细胞，抗体与细胞核反应。作为急性淋巴母细胞白血病的标记，阳性率可达90%以上。免抗体可用于石蜡切片（须微波处理）。计数100个肿瘤细胞，多于10%的细胞表达作为阳性。

（二） B系淋巴细胞

1 CD19 单抗来自克隆HD37，作为检测全B抗原的标志之一，在早期细胞即出现，直到浆细胞仍有反应，但多数骨髓瘤细胞丧失此抗原性，只能在涂片中检测。

2 CD20（或CD20cy）抗原是分子量为33000-37000的糖蛋白，有3个疏水区，4次穿越细胞膜，抗原决定簇位于胞浆内部分，其基因位于11号染色体的长臂12-13.1。来自克隆L26，抗体与正常或肿瘤细胞浆内的抗原反应，是检测全B细胞最常用的抗体，能应用于福尔马林固定的组织，不需要修复抗原，与CD3合并用于初步区别T和B淋巴细胞。

3 CD21 亦称补体受体2（CR2），是一个145000λⅠ型膜糖蛋白，是补体C3d的受体，抗体来自克隆1F8或鹅多抗。在B细胞活化和增殖中起作用。成熟B细胞中的表达，只能在涂片中检测。石蜡切片并经特殊的热处理修复抗原检测到的是滤泡内的树突细胞。

4 CD22 来自克隆4KB128或To15。是全B细胞抗体，用于检测正常及肿瘤性B细胞，两种抗体都只能用于涂片。

5 CD23 抗原为45000膜糖蛋白。抗体来自克隆MHM6，成熟B淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、血小板和树突细胞均表达。

6 CD24 抗体来自克隆SN3，抗原为35000-45000膜涎糖蛋白。在前B、早B和成熟B细胞中表达，在激活B细胞中表达降低，在粒细胞中也有存在。浆细胞中不存在。它在B细胞分化和增殖中起作用。

7 CD79α CD79是一个二聚蛋白质，分子量约70000，有2个多肽链，分别称为CD79α和CD79β。前者的基因位于19号染色体q13.2-13.3，后者的基因位于17号染色体q23，来自克隆JCB117是CD79α的抗体，以往称为Iga，来自克隆HM57的抗体作用于抗原的细胞内区。前一个抗体可显示B细胞肿瘤的细胞外区表达的抗原分子，用于涂片和常规切片，但不能用于流式细胞仪检测。

8 免疫球蛋白（Ig）抗人Ig的抗体有许多，分别与IgA(克隆6E2C1)、IgA的α链（兔多抗）、IgA、IgG、IgM的κ、λ（免多抗）、IgD（克隆IgD26）、IgD的δ链（免多抗）、IgE（克隆CIA-E-7、12，和E1）、IgEε链（免多抗）、IgG（克隆A57H）、IgG的γ链（免多抗）、IgG的CH2区（免多抗）、IgM（克隆R1/69）、IgM的μ链（免多抗）等，均可用于涂片和福尔马林固定的组织，但后者须经过抗原修复，免疫蛋白出现于B细胞胞浆(cyIg)早于细胞膜(smIg)，因此需区别胞浆阳性和膜阳性。

（三） T系淋巴细胞

1 CD2 亦称为E-玫瑰花受体，是分子量50000的跨膜蛋白，与CD58细胞外区的氨基端作用参与细胞粘附，促进T细胞活化，在T淋巴细胞、NK细胞和胸腺细胞中表达，单抗克隆为MT910，只能用于涂片，用作全T细胞抗体。

2 CD3 含5种多肽链，形成三种二聚体，各种单抗抗各个多肽。单抗有克隆T3-4B5和UCHT-1，只能用于涂片，免多抗（对CD3ε链）可用于福尔马林固定的组织（须经过抗原修复），用于检测正常和肿瘤性T细胞。

3 CD4/CD8 CD4亦称T4或Leu3，是分子量55000膜糖蛋白，含4个免疫球蛋白样区域，表达在T辅助细胞。CD8亦称T8或Leu2，是32000-34000细胞表面糖蛋白，表达在T毒性细胞。CD4单抗克隆为MT310，仅用在涂片。CD8单抗有两种：克隆DK25只能用于涂片。克隆C8/144B可用于福尔马林固定组织，但需修复抗原。CD4和CD8同时出现在一个T细胞，或一个T细胞没有CD4或CD8表达，均强烈提示为肿瘤性细胞。

4 CD5 是一个分子量67000Ⅰ型跨膜蛋白，70%正常外周血淋巴细胞表达CD5，事实上所有胸腺细胞与外周血T细胞均表达CD5。单克隆DK23（仅能用于涂片），克隆CD5/54/F6可用于福尔马林固定组织，（用微波修复抗原）但其结果不及涂片。95%正常人的T细胞表面有此抗原，B细胞淋巴瘤（中心细胞性）和慢性淋巴细胞白血病（B细胞性）亦表达。少数正常B细胞亦可表达。

5 CD7 是一个分子量40000Ⅰ型跨膜糖蛋白，表达于多能干细胞，多数人胸腺细胞及外周血T淋巴细胞。抗体用于检测T细胞性白血病。单抗克隆为DK24，仅能用于涂片。

6 CD10 亦称普通急性淋巴母细胞性白血病抗原（CALLA），是分子量100000Ⅱ型跨膜糖蛋白，出现在早期B和T前体细胞，B母细胞和一些粒细胞。单抗克隆为SS2/36，为急性淋巴母细胞性白血病的特异性抗体，对大多数其他类型的白血病均呈阴性。抗体只能用于丙酮固定的涂片。

（四）髓系细胞

1 CD11b 即C3b受体，亦称Mo1或OKM1。单抗克隆为2LPM19c。出现于粒细胞分化的后期和单核系细胞。抗体与单核细胞性白血病反应，少数急性粒细胞白血病细胞亦起反应。

2 CD13 或称MY7，来自克隆WM47。亦即氨基肽酶N，为分子量150000Ⅱ型跨膜糖蛋白，出现在大多数髓系细胞，包括单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒及粒系白血病。

3 CD14 或称MY4，来自克隆TUK4，是一个分子量55000的膜糖蛋白，表达在单核细胞、巨噬细胞及一部分粒细胞。它是脂多糖受体，脂多糖激活它而使巨噬或单核细胞分泌细胞因子。

4 CD15 来自克隆C3D-1，亦称粒细胞相关抗原，抗体与LewisX单糖反应，后者出现在成熟粒细胞和R-S细胞。

5 CD33 亦称MY9，为分子量67000Ⅰ型跨膜糖蛋白，出现在骨髓粒和巨噬系的前体细胞，但多能干细胞却缺如。外周血单核细胞也表达。是一种涎酸依赖的细胞粘附分子。用以鉴别髓系和淋巴、红白血病。抗体来自克隆WM-54。

6 CD34 来自克隆QBEnd/10，亦称MY10，是分子量105000-120000跨膜糖蛋白，在造血祖细胞中表达，它的胞浆区是磷酸化的靶，在信号传递中起作用。

7 髓过氧化物酶（MPO）单抗来自MPO7克隆。标记粒和单核细胞胞浆内的酶颗粒。但它与细胞化学显示的过氧化物的结果可不一致，因后者显示其功能，而单抗检测的是其抗原性，在肿瘤细胞中，二者可呈分离。

8 髓细胞/组织细胞抗原单抗来自克隆MAC387，标记粒细胞及单核细胞。

9 中性粒细胞弹力酶抗体来自克隆NP57，能与中性粒细胞及多数单核细胞起反应，可用于血、骨髓涂片及福尔马林固定的石蜡切片。

10 CD68 是一组酸性、溶酶体糖蛋白。它出现在胞浆内的颗粒，也可在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞及大淋巴细胞表面检出，它具水解功能，是溶酶体膜的主要成分。单抗来自克隆EBM-11（仅能用于涂片）、KP1和PG-M1，PG-M1特异的针对单核和巨噬细胞，对粒细胞无反应。

（五）其他

1 巨核细胞标记抗体 CD42b为血小板糖蛋白Ⅰb、克隆为AN51。CD41为血小板糖蛋白Ⅱb，克隆为5B12，CD61为血小板糖蛋白Ⅲλ，克隆为Y2/51。

2 红系细胞标记抗体（GlycophorinA或C）单抗分别来自克隆JC159和Ret40f，能与大部分红白血病细胞起反应

3 浆细胞标记抗体（CD38）克隆为AT13/5，不单出现在浆细胞，早期B系及T系细胞和激活的B和T细胞均表达。90%CD34+细胞表达CD38。

另一个来自VS38c克隆的单抗，仅对浆细胞内糙面内质网相关的P63蛋白反应。还有CD138为分子量30500的细胞表面蛋白质，抗体来自克隆M1 15。

4 自然杀伤细胞抗体

（1）CD56：来自克隆MOC-1或T199；

（2）CD57：来自克隆HNK-1；

（3）CD94：来自克隆HP-3D9。

二、白血病的免疫分型

按照正常白细胞的发育、分化和成熟的过程，许多抗原在这个过程的不同时期中出现（表达）和消失。根据不同的抗原出现和消失，决定白细胞的分化阶段。在正常白细胞分化过程中，常规染色的形态，细胞化学的反应与表达的抗原是一致的。

白血病细胞是肿瘤性的增生，它的分化、成熟与正常的分化是有差异的，可称之为“歧途分化”。因此，在白血病细胞的形态、细胞化学反应的免疫表型可以是不一致的，或可称为是“分离”的。还有，肿瘤细胞由于有基因的突变、融合或插入等异常，因而肿瘤细胞可丧失其来源细胞的抗原簇，也可“获得”它原来没有（不表达）的抗原簇，而与相应的抗体反应，如白血病细胞表达上皮性抗原——角蛋白。

根据白血病细胞的免疫细胞化学反应，进行的分型即白血病的免疫分型，是白血病治疗、用药根据之一，是国际交流必不可少的检查之一。为此，开展免疫分型号已经是血细胞检查的常规方法。但是，各实验室还得根据实际情况选择适当的抗体。

（一）淋巴细胞性白血病

1急性淋巴细胞性白血病相应的细胞发育阶段为淋巴母细胞，其免疫标记特点为TdT阳性，这是作为与髓系干细胞区别的要点（后者TdT阴性）。区别T系和B系的母细胞则依赖于HLA-DR（Ia）；B系阳性而T系阴性（注意：HLA-DR在髓系干细胞呈阳性）。其次CD19出现在早期B系细胞，也可作为区别T系和B系细胞的标志。CD7出现在早期T系细胞，它虽不存在于B系细胞，但一部分急性非淋巴白血病细胞亦可表达，需加注意，因此须与其他抗体同时应用，综合考虑。

2慢性淋巴细胞性白血病经典的慢性淋巴细胞白血病多数是B系细胞，瘤细胞有B系相关抗原（CD19、CD20、CD79α）。表达CD5+、CD23+、CD43+；CD11c+/-；但CD10阴性。少数为T系细胞，表达CD7+和其他T细胞相关抗原（CD2，3，5阳性）；多数CD4+，有些CD4、CD8均阳性，极少数CD4、CD8均阴性，而CD25阴性。

3非典型慢性淋巴细胞白血病及淋巴瘤并发白血病慢性淋巴细胞性白血病的特征标志是CD5+和CD23+，若这二者均阴性，则为非典型慢性淋巴细胞白血病。其中主要的是前B细胞性白血病。淋巴瘤并发白血病者，瘤细胞的免疫表型与原发灶中的基本相同。

4多毛细胞性白血病瘤细胞的免疫表型为sIg+、B细胞相关抗原（CD19、CD20、CD22、CD79α）阳性；CD5、CD10、CD23均阴性，CD11c和CD25强阳性，FMC7和CD103阳性，这个标志的阳性意义最大，但前三者亦可出现在多毛细胞白血病之外的情况。

5浆细胞性白血病多数sIg阴性而cIg阳性，B细胞相关抗原多数阴性，但CD79α可呈阳性。浆细胞特异性抗体和CD38阳性。

6大颗粒淋巴细胞性白血病（T细胞或NK细胞）两种白血病细胞的免疫表型分别为：T细胞型：CD2+、CD3+、CD5+、CD7+、TcRαβ+、CD4-、CD8+、CD16+、CD56-、CD57+/-、CD25-；NK细胞型：CD2+、CD3-、TcRαβ-、CD4-、CD8+/-、CD16+、CD56+/-、CD57+/-。

（二）非淋巴细胞性白血病

髓系细胞抗体反应与急性非淋巴细胞性白血病M1-M7之间的关系如下表：

表4-1 急性非淋巴细胞白血病免疫分型

抗体	M1	M2	M4	M5	M3	M6	M7
HLA-DR	+	+	+	+	-	+/-	+/-
CD34	+	+/-	+/-	+/-	-	-	+/-
CD33	+	+	+	+	+	+/-	+/-
CD13	+/-	+	+	+	+	-	无报道
CD11	-	+	+	+	+/-	-	无报道
CD15	-	+	+	+	+/-	+/-	无报道
CD14	-	+/-	+	+	-	-	无报道
血型糖蛋白	-	-	-	-	-	+	-
血小板GPⅡb/Ⅲa/Ⅰb	-	-	-	-	-	-	+

急性早幼粒细胞白血病细胞与PML抗体反应。

慢性粒细胞性白血病，一般表示髓系标记抗原MY9（CD33），还可表示ABL/BCR融合基因产生的蛋白质抗原。

（三）双系和双表型白血病

白血病同时有淋系和髓系标记抗原的瘤细胞为双系型白血病。

同一个白血病细胞表达淋系和髓系抗原者称为双表型白血病。目前“确认”的系限表达标志（lineage-restricted markers）为：（1）粒系：过氧化物酶、CD34、CD13；（2）单核系CD34、CD13、CD14；（3）红系：血型糖蛋白；（4）巨核系：血小板糖蛋白；（5）B细胞系：表面或胞浆免疫球蛋白，CD19、CD20；（6）T细胞系：CD5、CD3、CD2、CD7。CD57常在慢性B淋巴细胞白血病表达，不认为双表达。CD2和CD7在少数急性非淋巴细胞白血病细胞中表达亦不认为是双表达。

此外，还有一种在白血病治疗和病程进展过程中，白血病细胞免疫表型发生转变，称为细胞系转变型。

上述3种统称为混合性白血病。

三、与白血病细胞生物行为有关的抗原

（一）增殖有关的抗原

1．增殖细胞核抗原（PCNA）来自克隆PC—10，有增殖细胞细胞周期S期时表达最高，计算其百分率可以代表细胞的增殖速度。

2．Ki-67克隆除来自Ki-67克隆外，还有来自Ki-S5克隆，抗原为核蛋白，在G1、S、G2和M期表达，不出现在G0期细胞。

3．分裂蛋白（Mitotic Protein）克隆为MPM-2，抗体与分裂期的一种蛋白作用。可显示分裂期的细胞。

（二）凋亡有关的抗原

1．CAS蛋白（Cellular Apoptosis Susceptibility）显示细胞对凋亡的易感性。

2．Bcl-2 来自克隆124及克隆100。参与细胞凋亡，起抑制凋亡的作用。在急性粒细胞白血病中表达增高，提示对药物疗效差。

3．Bcl-6 基因编码一个706个氨基酸的核蛋白，在滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤及结节型淋巴细胞为主的霍奇金病，但在B细胞慢淋、毛细胞白血病及套区和边缘区淋巴瘤中不表达。

4．Bcl-X 与Bcl-2为同一家族，亦为控制凋亡的一种癌蛋白。

5．Bax 亦为Bcl-2家属成员。抗体为兔多抗。其作用为促进凋亡。抗体标记胞浆中颗粒。

6．P53 来自克隆DO-7。抗体显示突变型P53。P53抗体与野生型P53的功能产生P21WAF1/CIP1和MDM2蛋白的抗体（P21WAF1/CIP1克隆SX118和MDM2抗体克隆SMP14）联合应用，可出现4种不同结果（1）P53+MDM2-P21-；（2）三者皆阳性；（3）三者皆阴性；（4）P53-MDM2-P21+分别代表P53的基因状态。

7．FAS（CD95）抗体可来自克隆APO-1，DX2和DX3。这种膜蛋白与FAS配体结合启动凋亡。

四、某种白血病特异的抗体

（1）早幼粒细胞白血病：PML蛋白，抗体来自克隆PG-M3。抗体与PML-RARα融合蛋白反应而染上细胞核。此抗体虽不与其他类型白血病细胞反应，但能染上R-S细胞、喉癌、乳头状甲背离腺癌、上皮性胸腺瘤和Kaposi肉瘤的瘤细胞。

（2）多毛细胞白血病：下列3个抗原可作为多毛细胞的标记：①DBA44：多数多毛细胞白血病细胞呈阳性反应；②FMC7；③CD103：亦称粘膜淋巴细胞抗原（MLA），抗体来自克隆Ber-ACT8。抗原属integrin家族，95%上皮细胞内CD8+细胞和40%粘膜相关T细胞，外周血淋巴细胞呈阳性反应的少于2%。T细胞恶性肿瘤及多毛细胞白血病细胞呈阳性反应

（3）套区淋巴瘤：Cycline D1为Bcl-1/Cycline D1蛋白。

（4）间变型淋巴瘤Rimaze蛋白:P80。

（5）细胞毒性T细胞及NK细胞：TlA granzyme B。

第二节细胞免疫标记技术

细胞免疫化学是细胞化学吸收了免疫学的理论和技术而发展起来的一门重要方法学。在现代医学领域中被广泛应用。尤其在细胞学中该技术的应用是微观世界形态学研究从单一的形态学描述上升到结构、功能和代谢为一体的动态观察。并可对细胞的属性、分化阶段和变异进行鉴别，有助于临床疾病的诊断。

细胞免疫标记技术的方法学建立至今仅有30年左右的时间，但其发展异常迅速，检测方法可多达20种以上。其基本原理是将组织和细胞作为抗原，与其相应的特异性抗体产生抗原-抗体反应，并借助荧光色素、酶、胶体金、铁蛋白等显示系统，在被测组织和细胞所相应的位置显示出来。由于抗原-抗体系统具有高度的特异性和敏感性，能够将细胞形态学和功能代谢紧密的结合起来进行观察和分析。目前实验室常用的方法有免疫荧光法，PAP法，ABC法，IGSS法等10大类。但由于各种方法均有其特性和检测适应范围，即某一种方法不可能在所有检测标本中被应用，我们应充分发挥各种方法上的特点，有选择性的将不同来源的组织和细胞标本并选用不同的方法来进行检测。使我们的检测结果更精确。

一、免疫荧光细胞化学技术

免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微显示的精确性相结合，用已知的抗体在不影响其免疫学特性的前提下与荧光素相结合。然后将结合了荧光素标记的抗体作为一种标准试剂。对被检细胞进行检测和鉴定。并在荧光显微镜下采用一定波长的荧光，可以直接观察被检测中有否特异荧光的表达。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）、四甲基异氰酸罗丹明（TRITC）及藻红蛋白（PE）在流式细胞术（FCM）中较常用。

荧光抗体技术在血液细胞学中常用于检测各种血细胞的表面抗原和受体。较为经典的方法有下列几种：

（一）直接法

是以荧光抗体直接与被检标本内的抗原反应。依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制备大量特异性的荧光抗体。操作方法为：

1．固定涂片经固定（丙酮10min）后，PBS充分洗涤3min×3。

2．孵育添加工作浓度荧光抗体如鼠抗人CD3（CD-FITC）。于湿盒内在37℃中温育60min。

3．洗涤 PBS洗涤3min×3。用0.1%伊文兰反衬染色3min，PBS洗涤3min×3后以蒸馏水洗涤2min。

4．观察甘油封片（9份甘油+1份PBS），镜检。

直接法应设有阴性、阳性标本对照，抑制试验对照。若采用分离纯化较高的单克隆抗体可省略伊文反衬染色。

（二）间接法

间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定时间后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素标记抗抗体使之形成被检抗原-抗体-荧光素标记抗抗体复途中物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光标志物，所以其敏感性比直接法要高。操作方法为：

1．固定涂片经固定（丙酮10min）后，PBS充分洗涤3min×3。

2．孵育添加工作浓度第一抗体如鼠抗人CD3。于湿盒内在37℃中温育60min。

3．洗涤 PBS洗涤3min×3。添加工作浓度荧光素标记抗体羊抗鼠IgG-FITC，于湿盒内37℃40min。

4．观察 PBS洗涤3min×3。甘油封片（9份甘油+1份PBS），镜检。

间接法应设阴性，阳性标本对照。另还应设中间空白对照

（三）补体法

这是一种间接法的改良。既在抗原抗体反应时加入补体，然后再与荧光素分别标记的抗补体抗体结合形成抗原-抗体-抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高，但其较易出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。

（四）双标记法

运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同一标本上测定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用间接法进行。若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体，甚至可以进行三重或多重标记法。

二、免疫酶细胞化学技术

免疫酶细胞化学技术是将抗原-抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了它们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶代替荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。目前可选用的标记酶有辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP、葡萄糖氧化酶GOD、β-D半乳糖苷酶（β-D-Gal）等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且价格适中，其中前两种酶已由美国Vector公司组成商品化出售，广泛地被临床和实验室所应用。

（一）辣根过氧化酶免疫酶标记法

辣根过氧化酶是从辣根中提取的一种糖蛋白，其作用底物为供氢体和过氧化物。目前常用的供氢体为二氨基联苯胺（DAB）。在酶反应过程中DAB不断供给复合物电子，使其成为在光镜下能观察到的不溶性深棕色多聚合物。定位于酶活力处即抗原-抗体反应部分。现常用的方法有直接法、间接法、抗体-桥联法、过氧化酶-抗-过氧化酶复合物法（PAP）及亲合素-生物素-过氧化酶复合物法（ABC）等。在血细胞相关抗检测中通常使用PAP法和ABC法这两种。操作方法为：

1．过氧化酶抗过氧化酶复合物法（PAP）

（1）固定：涂片经固定（丙酮10min）后，PBS充分洗涤3min×3。

（2）预处理：1%H2O2-甲醇（或H2O2-过碘酸）阻断内源性过氧化物酶10～20min，PBS洗涤3min×3。

（3）加单抗：滴加工作浓度第一抗体置湿盒25℃30min，PBS洗涤3min×3。

（4）加二抗：滴加工作浓度第二抗体置湿盒25℃30min，PBS洗涤3min×3。

（5）加联接物：滴加与第一抗体同种鼠源性PAP复合物，置湿盒25℃60min，PBS洗涤3min×3。

（6）显色：0.04%DAB+0.03%H2O2显色5～10min，流水冲洗2～3min。

（7）观察：苏木精复染，甘油明胶封片，镜检。阳性为棕褐色沉淀物。

2．亲和素-生物素-过氧化酶复合物法（ABC-HRP）

（1）固定：涂片经固定（丙酮10min）后，PBS充分洗涤3min×3。

（2）预处理：0.3%H2O2-甲醇10～20min，消除内源性过氧化物酶，PBS洗涤3min×3。

（3）加单抗：添加工作浓度第一抗体，置湿盒内室温（25℃）60min，PBS洗涤3min×3。

（4）加二抗：添加生物素化二抗（1：200）置湿盒内（25℃）30min，PBS洗涤3min×3。

（5）加联接物：添加ABC复合物（临用前30min将亲和素与生物素-HRP混合），置湿盒内（25℃）30min，PBS洗涤3min×3。

（6）显色：0.04%DAB+0.03%H2O2显色5～10min，流水冲洗。

（7）观察：苏木精复染，甘油明胶封片，镜检。阳性为棕褐色沉淀物。

第三节免疫标记在白血病分型诊治中的应用

免疫标记技术的进展已经超出了单纯追求发现、克隆和纯化相关抗体，如CD系列抗体的阶段。正在对细胞的基因、染色体、胞质中成分、跨膜表面蛋白载受体以及可溶性蛋白等进行全面的检测，研究和评估。正因为如此，免疫标记不再单纯地为白血病免疫分型服务，也不仅仅是MIC分型诊断中的一个方面，而是介入白血病发生、发展全过程的表型检测。在此，结合瑞金医院血液教研室近5年来对1000多例初发白血病的细胞免疫标记数据，作如下综述。

一、免疫标记在白血病免疫分型中的应用

（一）急性B淋巴细胞白血病

这类急性淋巴细胞白血病（acute lymphocy、CDtic leukemia，ALL）占所有ALL的85%左右，常用的有一定价值的标记抗体有HLA-DR/Ia，这虽不是特异性的B细胞标记物，却是99%以上的B系统ALL的阳性表达标记。CD19和CD24对此类白血病细胞表达的敏感性接近HLA-DR，且有较高的特异性。CD20和CD22与CD19和CD24有相同的特异性，但敏感性不够，CD20的表达往往伴随性CD19的阳性而出现。CD10（CALLA）的表达可出现在90%的B系统ALL的原始细胞上。一般来说，这类白血病患者有超过一半，甚至2/3以上，在免疫表型中出现淋巴细胞分化的明显不协调，如，CD22阳性与CD34表达同时出现在ALL白血病细胞上。正因为如此，免疫标记需要综合分析。

1．早期B细胞ALL（Early Pre B Cell ALL）早期B ALL白血病细胞的特点在于无浆内膜上的免疫球蛋白标记和浆内μ链的表达。但可表达CD19或CD24或重链基因重组等B祖细胞阶段的标记阳性。早期B ALL在儿童ALL中占70%，成人ALL中占50%多。其中儿童的早前B ALL中有90%表达CD10，而在早些时候被归类于普通型ALL（c ALL）。这一亚型中伴有CD34、CD10同时阳性的预后较好，TdT和5*核苷酸酶活性增高的患者也有这种预示作用。

2．前B细胞ALL（Pre B Cell ALL）此类亚型的B系统白血病特征是出现胞浆μ链，而列轻链或膜上免疫球蛋白的标记。其中90%以上的患者，白血病细胞可表达CD10，FAB分类中，主要归类于FAB L1。其他TdT、HLA-DR、CD20和CD24均可阳性表达。

3．转化型前B细胞ALL（“Transitional”Pre B Cell ALL）在ALL中不到1%，其白血病细胞胞浆和表面μ链表达阳性，但无轻链表达。可以认为是前B与B细胞间的过渡型细胞，用FCM检测DNA指数可发现大于1.16，临床上无明显髓外表现，在儿童患者中，显示较前B细胞ALL更长的生存期。

4．B细胞ALL（B Cell ALL）此型在ALL中占1%-2%，表面IgM表达是它的特征。另外HLA-DR、CD19、CD20和CD24阳性，CD10和TdT通常不表达。B细胞ALL中的75%属于FAB L3型。细胞形态和细胞遗传学特点与白血病期的Burkitts淋巴瘤极其相似，后者呈现TdT阴性和明显的λ轻链表达

（二）急性T淋巴细胞白血病

15%的ALL属于这类白血病，根据白血病细胞的特点可分为胸腺细胞型（prothymocytes）、中间（普通）胸腺细胞型（intermediate thymocytes）、和成熟胸腺细胞型（mature thymocytes）。CD7有白血病细胞上的表达是所有T-ALL中最敏感的。但由于个别T-ALL CD7阴性，因此诊断和分型时必须考虑与CD5、CD2标记同时检测，要注意的是，三分之一的T-ALL患者CD2可能阴性，而CD2与CD7在5%-30%的急性髓系白血病中，可呈阳性表达。T-ALL患者HLA-DR阴性，其中绝大部分表现出胞浆CD3阳性而表面CD3阴性的特征，当然这种情形在正常或肿瘤病变时的NK细胞上也可出现。CD7是泛T细胞的标记，与正常人早期T细胞标记抗原协同表达不同的是，T-ALL的白血病细胞常常只有CD7的阳性，南昌CD4和CD8阴性。T细胞受体（TCR）基因重组的检测是T-ALL诊断中常用的，但考虑到TCRσ也出现在B细胞系统和髓细胞急性白血病时，故常以TCRβ作为检测目标。T-ALL中主要是幼稚胸腺细胞型，其他两种类型细胞主要见于恶性淋巴瘤。

（三）急性髓细胞白血病

急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）以前称为急性非淋巴细胞白血病（acute non-lymphocyeic leukemia，ANLL），这类白血病细胞的免疫表达种类繁杂，缺乏特异性和敏感性（与ALL相比）。很多情形下，白血病细胞的标记也出现在正常的髓细胞表达上。以常用的标记为例，CD33可出现在正常原始粒细胞、早幼粒细胞、粒细胞和单核细胞，也在80%-90%的AML白血病细胞表达；CD13与CD33在正常细胞表达上类似，但对AML白血病细胞的表达为70%-80%；CD11b、CD14、CD36对单核细胞的表达有一定特异性，尤其是CD14和CD36。但CD11b阳性也可出现在5%-10%ALL中，CD14则可表达在1%左右的ALL中；HLA-DR是除APL外，在差不多所有髓细胞白血病均可表达的免疫标记；CD4标记则可在65%的AML中量阳性表达，尤其是CD2阴性的AML，包括出现在FAB AML M0和M1型中；CD15则在分化较好的AML中表达；血型糖蛋白A表达在除红系祖细胞外的红系细胞上，占FABM6患者的40%左右，CD71可弥补血型糖蛋白的不足，在BFU-E和CFU-E阶段的细胞亦可表达阳性；CD41、CD42和CD61是常用的原始巨核细胞标记，但CD61往往随CD41、CD42的阳性而表达。另外，CD56作为神经细胞粘附分子（NCAM）通常在NK细胞和T细胞上表达。在13%-41%的AML中，CD15表达阳性；在分化的单核细胞和t(8；21)、+8等核型改变时，也呈阳性表达。就NK细胞而言，HLA-DR、CD34和CD16为阴性，CD33、CD13、CD56和CD11b为阳性。

（四）髓系分化抗原在急性淋巴细胞白血病中的表达

最常见的单个核抗原在ALL的表达，依次为CD13、CD33、CD14和CD15。在成人ALL中，10%-20%有髓系抗原的表达；儿童ALL中则为5%～10%。CD13表达占6%～16%，CD33表达占3%～10%。对成人而言，ALL中髓系抗原的表达预示着预后较差，儿童ALL则无明显差异。CD15的阳性，主要表现在早期B细胞ALL，往往是常染色体11q23异常的患者；CD14表达阳性，则表现在ALL的t(9；22)改变或T-ALL或B-ALL中CD34和HLA-DR阳性的患者。有10%的ALL，主要是T-ALL，可存在超结构的髓过氧化物酶反应（EM-MPO positive）。

（五）淋巴系分化抗原在急性髓细胞白血病中的表达

除CD4可表达单核细胞、巨核细胞外，20%-30%的ANLL可有淋巴抗原的表达。其中TdT阳性有5%-45%，CD7阳性有10%-18%，CD2阳性占5%-12%，CD19占4%-8%。较少的还有CD3（1%），CD10（1%-5%），CD20（6%）。淋巴抗原表达与AMLTdT阳性无相关性，CD19阳性与ANLLt(8；21)有关，CD2表达与APL的M3V和FAB-M4EOS有关。

（六）未分化和双表型白血病

在免疫分型介入前，急性未分化白血病（AUL）占急性白血病的15%-20%，目前只占5%不到。其主要特点是白血病细胞存在免疫球蛋白或TCR基因重组，通常为CD34、HLA-DR、CD38和CD7阳性，而其他T、B细胞标记、髓细胞抗原及超结构MPO阳性。

双表型白血病，有时也称混合型白血病，目前主要有3种不同形式：①双表型，单个白血病细胞同时表达髓系、淋巴系细胞的特点；②双细胞系型：两个（不同的单个）白血病细胞呈现髓系、淋巴系或T、B细胞的特点，这一型白血病细胞可能来自单一祖细胞，也可能来自不同的干细胞，后者被称为真正的双克隆型白血病；③系转变型，经治疗或缓解后复发发现免疫表型改变，或初诊确定为双细胞系型，治疗后显性克隆消失，出现新的克隆或克隆的扩展，但后者很难鉴定，往往需依靠染色体和基因检测。

（七）慢性白血病

1．慢性粒细胞性白血病慢性粒细胞性白血病（慢粒）本质是一种较严重的慢性骨髓增生性疾病，是克隆性疾病，也是一种干细胞病变。由于病变涉及粒系、红系、巨核系、单核系甚至淋巴系细胞，因此慢粒白有高度异质性。无论是慢性期、加速期，还是慢粒急变期，其细胞类型都是难确定的，而免疫表型分析也就显得更为重要。一般而言，慢粒的粒细胞型以各阶段早期粒细胞和成熟粒细胞为主，在骨髓病理检查中呈典型的ALIP分布，并有较高的CD13、CD33和CD15阳性表达；粒细胞-巨核细胞型，除上述表达阳性外，CD42、CD41a阳性亦已明显。一部分患者还可出现CD14、CD42、CD34、CD16和HLA-DR的阳性表达，但不能以此判断存在粒、单、巨核白血病。只有在单核细胞数占骨髓有核细胞40%-50%以上，才考虑慢粒的粒单或粒单巨细胞白血病可能。CD34和HLA-DR的阳性，对慢性急变的价值较高，据统计，在CD34和HLA-DR阳性表达后半年内，80%左右的慢粒病人发生急变。另外，CD34、CD14、CD11b阳性的类白血病反应是少的，类白血病反应一般只有CD13、CD33和CD15阳性。

慢性淋巴白血病急变以HLA-DR、CD9、CD10、CD19表达为主；巨核系急变除CD41、CD42表达外，还呈HLA-DR、CD9、CD13阳性；尚有极少数为急性未分化白血病和B淋巴与粒系杂合急变。

慢性淋巴细胞性白血病慢性淋巴细胞性白血病（CLL）以B-CLL为主，占90%左右。最主要的免疫表达阳性有CD20、CD19、表面免疫球蛋白，并且有半数左右的患者呈λ或κ的阳性。一般国外报道T-CLL不超过3%，但在我国可达10%-20%，通常以CD3、CD5表达为主，CD4和CD8往往同时表达，细胞受体基因重组的检测（rTCR）是比较特异的。

二、免疫标记在白血病FAB分型中的应用

（一）急性淋巴细胞白血病

急性淋巴细胞白血病FAB分型以白血病细胞大小、染色质疏松程度、核仁清晰状况和细胞质内容物分为L1、L2、L3三型。其中L3至今没有见到T细胞涉及病变的报道，L1和L2T、B细胞参与的概率是不同的，T-ALL占25%，B-ALL占75%。

1．ALL-L1 据瑞金医院血液教研室统计，L1型急淋中B细胞型与T细胞型之比为3：1。B系分化抗原中以CD19、CD24的平均98%的表达率高居榜首，CD22以85%次之、CD20表达不足30%。与国外报道一样，CD21在ALL-L1中的表达极低，只有1%左右。而B细胞L1中，伴髓系分化抗原阳性的有5%左右，其中以CD68为最多，其余依次为MPO、CD13、CD33；伴T细胞阳性的仅1%，且只有CD7表达。T系分化抗原中以CD7的90%的表达率占首位，膜CD3表达阳性次之，为88%。CD2和CD5阳性表达均为70%左右，而大部分T-ALL-L1白血病CD4、CD8阴性或CD4+、CD8-或CD4-、CD8+，CD4+、CD8+的T-ALL-L1白血病只有4%左右。CD1阳性的T-ALL-L1型有20%，较国外报道明显增高。与B-ALL-L1型相对较高的髓系分化抗原伴随表达不同，T-L1型的髓系抗原表达仅占1%-2%，且只有CD68阳性。T-ALL-L1型中胞质中CD3阳性表达极少，在怀疑NK细胞时，可发现阳性。就ALL-L1型而言，CD10、HLA-DR、CD34等非特异性细胞系统的独立抗原阳性率，在不同ALL中有较大的区别。B-ALL-L1型中99%患者的白血病细胞HLA-DR呈阳性表达，90%的白血病细胞呈CD10阳性表达。无论是T-ALL-L1或B-ALL-L1CD34的阳性表达率还不及髓系分化抗原在ALL中伴随表达率。

2．ALL-L2 与L1不同，这一类型的ALL中，B细胞型与T细胞型之比为20：1。

B系分化抗原中以CD19、CD24表达率最高，均在97%左右，CD22次之，CD20占30%左右，CD21表达近乎于零，伴髓系分化抗原的表达中，以CD13为最，CD68和MPO次之，CD33和CD14亦有不少表达。总体的伴髓系抗原表达率为7%-8%，略高于ALL-L1型。T系分化抗原表达情况与ALL-L1相似，但CD3和CD2的阳性率要超过CD7，CD7和CD5相仿，占60%左右。只是在ALL-L1中无论T、B细胞，CD34的表达率明显增高，占10%左右。CD10阳性在B细胞L2型中占82%，HLA-DR的阳性表达率在B-ALL-L2中几乎达到100%。值得一提的是，B细胞-髓系细胞双表型白血病中，以L2为主，占了双表型白血病的80%，占ALL双表型中的90%以上。

3．ALL-L3 此类FAB分型尚未发现有T细胞的病变。

L3型的白血病细胞中，CD19和HLA-DR表达率为100%，CD22、CD24和CD21表达率为90%左右，CD79α没有预想的那么高，大约是80%左右，而CD10、CD38的表达为零，但CD34阳性却有10%。

（二）急性髓细胞白血病

1．AML-M0 1987年正式确定的极微分化型AML，以AML-M0来表示，到1991年才通行于全世界。这个类型是免疫标记技术在AML中应用的一个范例。可以这样说，没有免疫标记在白血病分型中的应用，就不可能诊断AML-M0。AML-M0通常是末端脱氧核苷转移酶（terminal deoxynucleotydyl transferase,TDT）阴性、淋巴系抗原阴性和小于3%的白血病细胞MPO表达，而以CD68、CD13、CD14和CD33中的一个或两个阳性表达为主。其中CD68表达率为45%、CD13为42%、CD14为13%、CD33为32%。某一分化抗原单独阳的为52%，两个分化抗原阳性的占40%左右，两个以上阳性的不超过5%。

2．AML-M1 由于这类AML存在大量原始阶段的粒细胞，其成熟度极差，除MPO阳性外，主要是CD13、CD33、CD68和10%左右的CD14阳性表达，而HLA-DR的阳性率也可达30%左右。

3．AML-M2 在AML中，此型可占1/3以上。CD13、CD33、CD68在AML-M2白血病细胞上的表达率各占1/3。CD4和CD2也可出现伴随阳性，占10%～15%，但CD19和CD34在所有M2型白血病细胞中均为阴性。

4．AML-M3 急性早幼粒细胞性白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）目前国内也将过去的M3a、M3b亚型归入相应的国际上通用的M3a和M3v亚型。其中CD34、HLA-DR在M3a不表达，而CD2在M3v不表达，其余免疫表达类似于M2型。即MPO达100%，CD68占90%，CD13和CD33均为85%左右，CD14为14%。2%左右的M3患者可伴淋巴系抗原，其中M3a以CD2为主，M3v以CD3为主。

5.AML-M4 M4均属粒单细胞白血病，但免疫有较大差异。M4a、M4b和M4c以CD13、CD68、CD33表达为最，分别是75%、82%和78%。MPO阳性率可达95%以上。CD14的表达较国外报道低，大约在30%，M4a、M4b和M4c之间无明显差异。但M4_EOS则很不一致，以CD13和CD34表达最高，可达80%左右，其他依次为CD11b、CD11c、CD14和CD33，并有15%M4_EOS伴CD2和HLA-DR的阳性。

6.AML-M5 急性单核细胞白血病占AML的10%左右，无论是M5a，还是M5b均以CD68的表达率最高，可达99%以上；其次为MPO，占90%；CD33为60%，CD13为48%，而CD14也只有36%。可见CD14对单核细胞的特异性和敏感性均未达到临床的预期值。CD136初步应用结果显示，在M5白血病细胞的阳性表达可有65%左右，而更重要的是在M4以外的白血病细胞中阳性率不超过3%，在M4a、M4b和M4c中也可达到50%左右，预示着较好的应用前景。

7．AML-M6 虽然M6不到AML的5%，但诊断并不容易。除了血型糖蛋白A等几种特殊成分的抗原表达阳性和MPO、CD68、CD41等少数抗原阴性外，其余免疫标记没有特别意义，且与MDS等克隆性骨髓增生性疾病难以区分。

8．AML-M7 M7型白血病据国外统计，其发病率应该占AML的10%～15%，但由于诊断困难，国内发病率是较低的。AML-M7无论是小型原始巨核细胞增多型，还是不规则的幼稚巨核细胞增多型，均可表达CD13、CD33和10%左右的CD34。高达80%左右表达率的是特异的CD41、CD42b和CD61。瑞金医院血液教研室的经验是VMF抗体表达价值最高，其次是CD41，而CD42b和CD61的表达率还不及CD36。

（三）特殊类型白血病

1．B细胞型幼淋巴细胞性白血病（B-cell-prolymphocytic leukemia,B-PLL） B-PLL

形态上的临床表现上容易与B-CLL相混，免疫标记技术是较好的区别方法。B-PLLCD20、CD22阳性高达90%以上，而CD103、CD11c阴性，CD5阳性不足50%。这些结果既不同于B-CLL，也不同于B-ALL。

2．浆细胞白血病（plasma cell leukemia,PCL）浆细胞白血病可以是原发的，也可能是从浆细胞瘤转化而来。浆细胞白血病时，病变细胞有较高的CD38、PCA-1、CD56和CD85表达，而CD19、CD20、CD24、CD72和HLA-DR则阴性或极低水平的表达。

3．淋巴浆细胞样白血病（lymphoplasmacytic leukemia,LPL）浆细胞样淋巴细胞在原发性巨球蛋白血症患者的骨髓和血片中都可找到。当达到一定数量即可诊断为LPL。此时，白血病细胞的CD19、CD20和CD24表达明显，免疫球蛋白轻链、CD5和CD11b也有表达，且存在部分白血病细胞CD10和CD9阳性。

4．毛细胞性白血病（hair cell leukemia,HCL）HCL是一种特殊的B细胞白血病，其白血病细胞免疫表型特点是CD11c、CD22、CD25和CD103等表面抗原的高表达。同时，可有泛B细胞抗原的协同表达，如CD19、CD20和CD24。而CD3、CD4、CD5、CD8、CD10等为阴性。

5．大颗粒淋巴细胞白血病（large grauular lymphocyte leukemia,LGL）LGL在1977年被提出，1979年证实菘克隆性的免疫学异常，进而又分成T细胞LGL（T-LGL）和NK细胞LGL（NK-LGL）两种。其中T-LGL免疫表型呈CD3+、CD4-、CD8+、CD16+、CD56-、CD57+和HLA-DR+，并常伴T细胞受体（TCR）αβ+。NK-LGL以CD3-、CD4-、CD8-、CD16+、CD56+和CD57-为特征。

三、免疫标记在白血病治疗预后评估中的应用

（一）急性淋巴细胞白血病

就B细胞ALL而言，CD10和CD34协同表达于白血病细胞，则对化疗反应较好，且可提升生存时间。但如果在B细胞ALL中表达有TCR重排，尤其是TCRδ重排的，则预后极差。对FAB-L3中的某些特殊类型，如白血病细胞胞质或细胞表面有μ链表达的，是预后好的标志。急性T细胞白血病的预后都是很差的，尤其当T-ALL白血病细胞CD4-、CD8-时表达出表面CD7+，则预后更差，且对目前常用的所有化疗方案有抵抗。

（二）髓系标记的急性淋巴细胞白血病

10%～15%的儿童ALL和25%～30%的成人ALL，其白血病细胞可同时表达髓系抗原。但常见的CD13或CD33伴随阳性表达对预后的影响，目前正反两方面的结论都有。而CD34阳性对B-ALL是好事，对T-ALL或儿童ALL就预示着治疗无效；同样CD45在儿童T-ALL的表达无论在治疗还是预后上，就比B-ALL来得麻烦。

（三）急性髓细胞白血病

总体来说，AML的白血病细胞若表达CD34，则预后较差。若CD34和多药耐药基因（multidrug resistance gene,MDR）及相关蛋白P170协同表达则治疗困难。但M2和M4_EOS中的白血病细胞CD34阳性，且呈现t(8；21)或inv（16），则预后较好。一般而言，髓系白血病细胞CD13-、CD14-和HLA-DR+均有较好预后；白细胞功能抗原（CD11b和CD11c）在白血病细胞表面表达被认为会缩短生存期；CD56和细胞粘膜分子的表达可看作是易发生髓外病变的因素。

（四）淋巴细胞标记阳性的急性髓系细胞白血病

所有髓系白血病细胞，除表达CD2外，有其他淋巴分化抗原的表达都是预后不佳的因素。尤其是合并CD7、TDT阳性或髓系淋巴双表型白血病。

（五）未分化型和双表型白血病

急性未分化型白血病（acute undifferentiated leukemia,AUL）和急性双表型（混合型）白血病（acute biphenotypic /mixed lineage leukemia,ABL/AML）占白血病的15%～20%。在中国，据瑞金医院血液教研室的统计也有10%～15%，不管是否存在P170阳性或MDR表达，此类白血病对化疗反应极差。尤其是ABL中白血病细胞还存在CD34或CD38或HLA-DR或CD7阳性。

目前，某些胞质中酶表达的高低也可作为评估白血病预后的一人个指标，常用的有抗5核苷酸酶（CD73）、腺苷脱氨酶（ADA）、已糖胺酶和5-谷氨转肽酶等。

四、骨髓活检的免疫组织化学

骨髓活检的免疫组织化学检测不是一个常规的手段，只有在下列4种情况下，才有必要作免疫组织化学染色：干抽；灶性病灶；估计细胞数；淋巴瘤和白血病分类。在涂片未能决定时，须注意的是，骨髓穿刺中血凝块，在包埋切片之后，也可作免疫组织化学染色。

（一）免疫组化技术

1．材料的固定吸取的材料（包括血凝块）在下列溶液中固定24小时：

40%W/V甲醛 1L

水 9L

氯化钠 87克

冰醋酸 200毫升

然后在1～2琼脂中包埋。

2．脱水和包埋同常规石蜡切片。切片厚度为2～4μ。复水后抗原的修复，可以选用下列3种抗原修复液中的一种：0.01柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H2O)2.94g/L；0.01M碳酸氢钠(NaHCO₃)0.84g/L；0.01M HCL/柠檬酸钠缓冲液(Ph6.0，0.01M柠檬酸钠33ml，0.01M HCL 17ml)。微波（全功率）5min，可重复1次，然后留置在热溶液中10～15min。进行免疫组织化学技术。

（二）应用

1．干抽干抽发生在两种情况：（1）纤维化（表4-3）。（2）细胞丰富（表4-4）。

2．灶性病灶淋巴瘤、霍奇金病、癌，参阅其他章节。

3．估计细胞量（表4-5）。

4．淋巴瘤及白血病分类（1）淋巴瘤（表4-6）。（2）白血病（表4-7）。

表4-3 骨髓纤维化引起干抽的常见疾病及抗体选择

诊断	选择的抗体	克隆
转移性癌	角蛋白上皮膜抗原	MNF116 E₂₉
神经母细胞瘤	神经母细胞	NB84a
横纹肌肉瘤	Desmin Myoglobin	D₃₃ 多抗
霍奇金病	Ki-1抗原，CD30 粒细胞相关抗原，CD15	Ber-H2 C3D-1

表4-4 骨髓细胞丰富引起干抽的常见疾病及抗体选择

诊断	选择的抗体	克隆号
毛细胞性白血病	毛细胞巨噬细胞CD68 B细胞CD20cy	DAB-44 PC-M1 KP-1 L26
淋巴瘤白血病反应性	血小板糖蛋白ⅢaCD61 glycophorin C 浆细胞	Y2/51 Ret40f VS38C

表4-5 估计细胞量时常用抗体选择

*正常细胞类型*	选择抗体	克隆
巨核细胞（及前体）	血小板糖蛋白ⅢaCD61 内皮细胞CD31 VW因子	Y2/51 5C/70A F8/86
红系	glycophorin C glycophorin A	Ret40f JC15q
髓系	中性粒细胞弹力酶髓/组织细胞抗原（L1-抗原）巨噬细胞CD68 粒细胞相关抗原CD15	NP57 MAC387 PG-M1 KP-1 C3D-1
浆细胞	浆细胞 κ轻链 λ轻链	VS38C 多抗多抗
淋巴细胞	白细胞共同抗原	2B11+PD7/26
血管	内皮细胞CD31	JC/70A

表4-6 免疫组化淋巴瘤分类时所用抗体

	选择抗体	克隆
淋巴系	白细胞共同抗原	2B11+PD7/26
低度或高度恶性	增殖细胞核抗原 Ki-67抗原	PC10 多抗
B细胞	B细胞，CD20cy B细胞，CD79α	L26 JCB117
T细胞	T细胞，CD45_RO T细胞，CD3	UCHL-1 多抗
间变型大细胞淋巴瘤（B、T或null）	Ki-1抗原	Ber-H2
骨髓瘤	浆细胞	VS38c
（R或λ）	白细胞共同抗原	2B11+PD7/26

表4-7 免疫组化白血病分类时所用抗体

	选择抗体	克隆
普通型急性淋巴性白血病	B细胞CD79α	JCB117
T细胞急性淋巴性白血病	T细胞CD3	多抗
急性髓细胞性白血病		NP57 PG-M1 KP1
毛细胞性白血病	B细胞CD20cy B细胞CD79α 巨噬细胞毛细胞	L26 JCB117 PG-M1 KP-1 DAB44

第四节白血病细胞免疫表型流式细胞分型技术及意义

一、分析细胞学

细胞是一切生物体的基本结构单位的功能单位。细胞生物在医学科乃至生命科学中占有十分重要的地位。近代细胞生物学发展十分迅速，其研究方法逐步从传统的定性描述发展到定量的、细胞群体的研究，以获得更为客观的、具有统计学意义的测量数据，供进一步深入的研究。由此形成了一个新的领域，新的学科，即分析细胞学。

分析细胞学也称为定量细胞学。它既是细胞生物学发展中的一个分支，又代表着细胞生物学发展过程中的一个重要阶段。分析细胞是一个十分年轻的交叉学科，近20年来发展十分迅速。它的发展是与近代其他一些科学技术的发展密切相关的，其中特别是激光技术、数字计算机技术、电子物理技术、电子摄像技术、光电测量技术、荧光细胞化学技术和单克隆抗体技术等。

分析细胞学是从定量的角度对细胞的各种形态学参数、生物学特征、细胞生化成分的组成及含量以及细胞的各种功能等进行研究，将以往各种细胞学技术从定性、定位进一步发展到定量的研究，获得定量的测量数据，以便更客观地揭示生命活动的规律。随着分析细胞学技术方法学的标准化和质量控制，其各种定量测定数据可以在世界各实验室之间直接比较，或可直接合并成大样本研究，这是以往其他技术难以实现的。

分析细胞学作为细胞生物学的一个重要分支，它又是一个独立的学科。它具有特有的理论、研究方法和研究对象。然而，从医学科学和生命科学的角度出发，把它看作为一项新的有力研究手段可能更为恰当。这种新技术新研究手段与其他传统技术结合在一起，已活跃在医学科学和生命科学各领域的研究工作中，正进一步推动着各学科的发展。

分析细胞学技术的发展有两个主要领域，一个是固定式细胞分析，另一个为流动式细胞分析仪。固定式细胞分析是指细胞样品固定在载玻璃或培养皿上，分析系统由高品质的显微镜（包括透射显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜等）、电视摄像管（或光电倍增管）和数字计算机等组成。这种仪器可以高精度地定量分析单个细胞或细胞器，如染色体等的众多形态学参数，如细胞形态、细胞大小、面积、周长、直径、核/质比、胞浆颗粒、染色体长臂短臂比值等等，也可用于测量细胞内一些生化成分的含量。这类仪器一般都配有丰富的计算机图像处理软件，可对细胞显微图象进行各种分析处理，提取各种有价值的特征信息，确立细胞识别模式，通常被称为细胞图像分析系统。激光共聚焦显微镜（laser confocal microscope）是这一领域的最新发展。它可对活细胞三维立体结构进行断层扫描与图像重组，并能动态观察分析细胞内微量物质如钙离子等的分布变化与细胞功能状态的关系。新一代的激光共聚焦显微镜还配有细胞显微手术操作系统，成为当前细胞学研究强有力的一种手段。

与传统的将细胞固定在载玻片上的方法不同，流动式细胞分析分选系统要求将样品细胞悬浮在液体中。这些细胞悬液加入仪器后，高速度地流过售的检测区。仪器对悬液中每一个细胞进行分析测定，记录每一个细胞众多的生物学参数，并可根据预选定的条件将其中特殊的细胞亚群分选（sorting）纯化出来，单独收集以供进一步的细胞形态学，细胞功能学以及细胞分子生物学等的深入研究。这类仪器的名称过去较复杂，现已统一称为流式细胞仪（flow cytometer,FCM）。

流式细胞术从诞生至今近30年中经历了进一步发展和完善的过程。其测量参数由单参数向多参数发展，仪器的灵敏度、分辨率和稳定性等指标进一步改善。目前流式细胞仪的商业生产向两个方向发展。一个方向是发展小型的操作简便、性能指标稳定的临床常规型仪器。这种仪器使用方便，价格较低，能满足大部分临床医学研究工作的要求，但一般不附加有细胞分选功能。另一个方向是发展科研型流式细胞仪，这种仪器种种功能较强，并且配备各种分选装置，可以满足各种研究的众多要求。但一般价格昂贵，操作调试较复杂。

下面着重介绍流式细胞仪的原理、样品制备技术及其在白血病细胞免疫表型分析中的应用。有关激光共聚焦显微镜技术等内容将在其他章节分别给予介绍。

二、FCM分析术和分选术

回顾历史，细胞生物学的每一重大发展都是与其研究手段上的革命分不开的。FCM是继电子显微镜技术后细胞学研究手段的重大进展。这种技术能高速度地自动分析单个细胞的多个生物学特征或多种细胞生化成分的含量，一般在1～2min内就能完成对细胞大群体（几万个单细胞）的定量分析测定。这种细胞大群体的分析数据具有高统计学精度的特点，同时同一单细胞多参数相关分析可获得更多、更精确的信息。这是以往任何细胞学分析技术不可比拟的。FCM还可在对样品细胞多参数分析测定的基础上，结合多种细胞生物学参数特性，将样品中特定的细胞亚群高纯地分选（sorting）纯化出来，单独收集以供进一步的深入研究。

三、FCM的一般结构和原理

FCM从原理上讲是一种在计算机技术支持下的高度自动化细胞显微荧光脉冲分光光度仪。FCM的诞生与发展是与近年来激光技术、电子物理技术、光电测量技术、数字计算机技术，以及荧光细胞化学技术、单克隆抗体技术等的发展密切相关。

（一）FCM仪器的一般结构

FCM仪器一般可分为3个部分，即：①细胞流动室及其液流驱动系统；②激发光源及其光束成形系统；③细胞信号检测与分析、显示、记录系统（图4-1）。这3部分在仪器中一般按3个互为垂直的轴线安置，即X轴方向的激发光轴线、Y轴方向的细胞荧光信号检测轴线和Z轴方向的细胞流轴线。此3个轴线的交点即为仪器的细胞信号检测区。单个分散的细胞悬液进入细胞流动室后，由液体动力学技术保证，样品中的每一个细胞必须按顺序依次以相同的速度和相同的轨迹通过检测区。激光单色性好，平行度高，输出功率稳定。通过光束成形系统聚焦，可以得到照度十分均匀的检测区。每一个细胞以相同的速度和相同的轨迹流经该检测区时，受到激发光相同的光照。细胞受光照时产生细胞的散射光信号与荧光信号，这些细胞信号由仪器的检测器收集、分析、处理和记录。这就是流式细胞分析。

1．流动室与液流驱动系统流动室（flow chamber或flow cell）是流式细胞仪的核心部件。被检样品细胞悬液流经流动室时，由液体动力学层流技术保证，其中的细胞一个一个排列成单行，逐个以相同的速度和相同的轨迹依次通过检测区。因此，流动室也可称为单细胞流发生器。液体的流动一般可分为稳定流动和非稳定流动。在管道中液体稳定流动时是以管道的轴线为中心分层流动的。中心轴处流速度最快，中心轴外流速递减，即离中心轴越远流速越慢，各层液体流速的矢量分布与管径呈抛物线关系。根据液体动力学柏努利定律，液流速度大的地方压强小，而液流速度小的地方压强大。因此细胞在稳定流动的液流中始终趋向沿中心管轴方向运动。一旦细胞偏离了管轴，它就立刻会受到指向管轴方向的力的作用，重新再回到沿中心管轴的方向继续流动。同样的原理，非球形细胞流动时其细胞长轴总是与管轴方向一致。这种层流技术保证了样品中的每一个细胞都沿着流动室的中心轴运动，实现了每一个细胞以相同的速度、相同方向、相同的轨迹流经仪器检测区。同时，层流技术的应用还克服了以往用毛细管准直细胞流易阻塞的缺点。

2．激发光源与光束成形系统 FCM的激发光源大多采用氩离子气体激光器。一些FCM也配有其他各种激光器，如氪离子激光器、氦镉激光器、氦氖激光器、染料激光器和半导体激光器等。高压汞弧灯和氙灯等也用于少数FCM作为激发光源。激光（laser,light amplification by stimulated emission of radiation）是一种相干光源。它能提供单波长高强度的光照，这是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。在高强度的单色激光下，每一个细胞1～2μs内就可收集到足够强的荧光号。这是FCM进行高速细胞分析的基础，目前分析速度每秒可达数千或上万个细胞。氩离子（Ar+）激光器有多条可调的输出谱线，能与多种荧光染料激发谱匹配。同时氩离子激光器输出稳定性良好（输出功率误差小于1%），因而保证了荧光分析的高精度。激光的单波长输出有利于选择性地激发细胞内的各种不同荧光物质，避免和克服了荧光信号间的相互干扰。为了实现单个细胞的均匀照射，FCM一般都采用两块相互垂直放置的柱面透镜或一块柱面透镜和一块球面透镜所组成的光束成形系统对激光束进行适当的聚焦，形成截面为椭圆形的照射光斑。此光斑正处于FCM仪器中3条正交轴线的交点，即仪器的检测区。椭圆光斑的长轴垂直于细胞流与光束中心轴，而其短轴与细胞流轴线方向一致并重叠。典型的几何尺寸约为20μm×200μm，即短轴稍大于细胞的直径，而长轴远大于细胞的直径。这种椭圆形光斑的检测区保证了样品中细胞是一个一个分别受到光照并且每一细胞受检时都受到十分一致的光照激发。这就是FCM中的单细胞照明技术。

3.细胞信号检测与分析处理系统样品细胞流经仪器检测区时受到激发光的照射，同时就产生了细胞的散射光信号和细胞的荧光信号。这些信号以被检细胞为中心向空间360度立体角发射。细胞散射光信号是指激发光与细胞相遇作用后反射、折射、衍射等综合的结果。因此，细胞散射光信号的波长是与激发光波长一致的。细胞散射光信号在空间不同立体角位置的分布是不同的。经过大量实验研究，发现在前向小角度内收集的细胞散射光信号的强弱与细胞的大小及活力密切相关。对同一种细胞群体而言，其中大些的细胞，前向散射光信号也强些；较小些的细胞，其前向散射光也弱些。同一个细胞群体中活细胞的前各散射光信号要强于死细胞。而细胞的侧向散射光信号对细胞膜、胞质、核膜的折射更敏感，其中特别是胞质的颗粒成分。前向散射光信号检测器安置在激发光束的光路上，因此一般采用耐强光冲击的光电二极管。由于散射光信号的波长与激发光波长相同，故只能用一机械的挡光条而不能使用滤色片阻挡激发光束进入检测器。侧向散射光检测器一般都使用光电倍增管，其输入信号可与细胞的荧光信号一起由90度放置的一大口径透镜收集后，通过分束片和滤色片的适当组合，送入各自的检测器分析。

细胞的荧光信号取决于细胞荧光染色方法和所用的荧光素种类。荧光信号一般较弱，通常使用低噪音光电倍增管收集和分析。近年来由于荧光染料化学的迅速发展，单激光器FCM一般都配置有3个或更多个光电倍增管可分别接受3种或3种以上不同波长的荧光信号。并且附有荧光补偿电路来消除荧光光谱相互重叠带来的测量误差。配有2个或2个以上激光器的FCM则配置有更多的荧光检测器。光电倍增管及其电子放大电路可将荧光脉冲信号和散射光脉冲信号转换为相应的电脉冲信号，后者再通过模数转换器（ADC）量化为数字信号。数字信号可直接由计算机采集、分析、显示与存贮等。近年来发展的list mode多参数数据存贮方式大大提高了流式细胞分析技术的功能。它可完整地记录细胞群体的多个参数测量数据，可在实验检测结束后的任何时间重现检测分析过程，并可根据研究的需要，选择不同的参数组合与设门分析（将在FCM数据分析章节进一步介绍），进行各种不同的数据分析与处理。FCM的信号检测与分析系统一般还包括有各种信号波形的示波器，各种仪器参数的数字显示器，数字计算机及其显示器、彩色打印机和各种存贮器等。

4．FCM细胞分选装置 FCM可在高速分析细胞的同进，根据细胞多种生物学特性，将细胞群体中特殊的细胞亚群分选、纯化出来，进行进一步细胞形态学、细胞功能学以及细胞分子生物学等的研究。这是FCM技术的重要功能之一。FCM分选装置一般由超声振动器、液滴充电电路、静电高压偏转场和自动克隆器等组成。

（1）超声振动器：一般采用压电陶瓷晶片，将其固定在流动室的顶部。压电陶瓷晶片在输入的电脉冲的驱动下产生振动，其振动频率与输入电脉频率一致。振荡电脉冲频率一般设计在20～40kHz范围内可调。压电陶瓷晶片的振动导致流动室的强迫振动，此振动传递至流动室液流喷口后又沿液流表面传播。当晶片的振动频率调到与流动室固有频率之间成一定关系时，振动的能量传递效率最大，导致液流断离成滴。液流断离点一般离喷口5～8mm，可通过调节振荡电脉冲输入幅度加以适当调节。鞘液压力的改变也会影响液流断离点的距离。

（2）液滴充电电路：包含有要分选区细胞的液滴只有带上电荷才可能通过在电场中的偏转将其与其他液滴分离并可单独收集。使特定液滴电荷是在该液滴即将从液流上断离时对整个液流充电而实现的。整个液流充电时，处于断离端的液体表面的电荷分布密度较大。如果充电脉冲宽度持续到断离端的液滴形成分离后，则该液滴带有一定量的净电荷。调节充电脉冲的幅度可改变液滴所带净电荷的多少。延长充电脉冲的时间可使更多的接连断离的液滴串带上相同的电荷。充电脉冲可以是正脉冲，也可以是负脉冲。故液滴所带的电荷可以是正电荷，也可以是负电荷。正电荷液滴和负电荷液滴通过同一高压静电场时偏转方向正相反，故可分别单独收集。细胞的分选是在细胞分析的基础上进行的。细胞分析是在细胞刚从流动室喷出、距离喷口0.25mm处开始进行的。细胞从这里流到断离处一般要经历约0.5ms。在这段时间内仪器要对细胞多个参数进行测量与分析，并判断是否符合预定的分选参数组合范围内。如果确定是需要分选的细胞，就在该细胞到达液流断离端的即刻，由液滴充电电路发出一个充电脉冲，保证包含有该要分选细胞的液滴断离后带有净电荷，进而可偏转分选出来。

（3）静电高压偏转板：一对静电高压偏转板位于喷流断离处的稍下方。偏颇转板一般3～5cm长，垂直放置。静电高压一般为几千伏。带电液滴向下运动经过高压电场时，在静电力的作用下偏离原运动轨迹。带正电荷的液滴偏向负电板，带负电荷的液滴偏向正电板。静电高压值一般是固定的，调节充电脉冲幅度，改变液滴电荷多少，可改变充电液滴的偏转角和偏转距离。

（4）分选细胞的收集装置：分选所得的细胞可以用试管进行收集。一般情况下，根据细胞多个生物学参数，利用正、负充电方式可以同时分选纯化两个细胞亚群。配有自动克隆器装置的FCM，通过仪器计算机的控制，可将分选的细胞定量地（可以是单个细胞，也可以是一定数量的细胞）直接移入96孔培养板或24孔培养板等。也可将分选的细胞自动收集在载玻片上的相邻位置，供形态学检查等。由于采用List Mode存贮方式，结合分选后的细胞培养、细胞形态学检查观察、细胞图象分析等结果，可以综合单个细胞的更多信息，这是其他细胞学分析技术难以实现的。

四、细胞信号的检测与分析

被测样品中的细胞流经仪器检测区时受到激发光的照射。激发光与细胞相互作用后可产生散射光信号和荧光信号。

（一）细胞散射光信号

细胞对光的散射现象并不依赖任何细胞样品的制备技术（如固定、染色等）。新鲜的，未经任何处理的细胞受到光照时同样产生光的散射现象。因而可以利用散射光信号直接对未染色的活细胞进行分析和分选。经过对细胞在各个不同方向上散射光信号的研究，发现前向小角度散射光信号和90度侧向散射光信号中包含有被测细胞的一定形态学信息。

1．前向角散射光信号（forward scatter,简称FSC）前向角散射光信号与被测细胞的大小有关。较确切地说，是与细胞直径的平方密切相关。对同一种细胞群体而言，其中大些的细胞，前向散射光信号也强些；较小的细胞，其前向散射光也弱些。在FCM实际应用中，前向角散射光信号常被用于设阈以排除样品中各种碎片对被测细胞的干扰。也常用于设门排除细胞团块等。同种细胞群体中，前向角散射光信号还被用于区分死活细胞。因为细胞死亡后，其前向角散射信号强度会明显减弱。

2．侧向角散射光信号（side scatter,简称SSC）侧向角散射光信号包含有细胞内部结构形态学信息，特别是细胞浆中的颗粒性成分。实际工作中，侧向角散射光信号常被用于血液和骨髓样品中区分中性粒细胞与其他白细胞或造血细胞等等。同一个细胞群体中部分细胞生理或病理状态的改变，细胞内“颗粒性”等发生变化，其侧向角散射光信号随之也会改变。如细胞凋亡时常见其侧向角散射信号变大，而前向角散射光信号因细胞脱水而减小。

前向角散射光信号与侧向角散射光信号组成细胞双参数散点图是目前FCM细胞多参数分析中一种常用的测量和显示方式。它能反映细胞群体及其不同亚群形态学的一些信息，并且不依赖细胞样品的荧光染色过程。实际工作中常以此来鉴别细胞碎片和细胞团块，并通过设阈设门等加以排除。也常用前向角和侧向角散射光信号双参数测量来识别样品中的不同细胞亚群，如在外周血白细胞中区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，或在全血样品中设门找出血小板群体等。除此之外，在其他一些工作中双参数散射光信号测量还常能提供一些其他有用的信息。

（二）细胞的荧光信号

未经荧光染色的样品细胞在激发光的照射下可测到有微弱的荧光信号，称为细胞的自发荧光。FCM检测分析的细胞荧光信号主要是指经过荧光染色后细胞受照发射的特异荧光信号。各种特异荧光染色方法是针对细胞内各种不同的生化成分或各种特异抗原等设计的。每一种荧光染色方法中必须用到一种或更多种的荧光染料。必须保证荧光染料与所研究的细胞参数的结合是特异的和呈定量关系的。这样通过对细胞荧光信号的分析和测量就能了解所研究的细胞生化成分或各种特异抗原的存在与否和多少。荧光染色所用的荧光素有多种多样。由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选择荧光素时必须考虑其激发谱的峰值应与所用FCM激发光源相匹配。各种荧光信号的收集通常要注意选择合适的分束片与滤色片。近年来荧光素化学技术发展很快，现在已可做到用一束激光（488nm）激发3种染料（甚至4种染料）而得到各自波长不同的荧光信号。这已能满足目前大多数研究工作的需要。由此可见，荧光染料化学技术的发展对降低仪器造价，推动FCM的应用，起着十分积极的作用。

1.荧光信号的线性测量和对数测量细胞内生化成分含量的荧光测量时通常使用线性放大器，即放大器的输出与输入呈线性关系。输入信号增大几倍，输出也增大几倍。但在细胞膜表面抗原的荧光检测时则通常使用对数放大器。即如果原来输出是1，当输入信号增大么原来的10倍时输出为2；当输入增加到原来的100倍时，输出为3等等。这是因为细胞膜表面抗原等的分布有时要相差几十倍，甚至几百倍（图4-2）。

细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等测量一般都用线性测量。要求高的场合，如细胞DNA倍体分析等采用荧光通量积分测量，即“面积测量”。面积测量技术可以排除样品细胞非球形和流过检测区时取向不同而带来的误差，提高了总荧光通量测量精度。

2．荧光光谱重叠与其校正方法用一束激发光同时激发两种或两种以上不同荧光素时，可获得它们各自不同波长的荧光信号。由于无法从空间上与时间上分别检测同一细胞上的不同波长的两种荧光信号，一般采用分束片和滤色片的适当组合，将不同波长的荧光信号送入各自的光电倍增管。由于目前FCM细胞样品制备中所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质的，虽然它们之间各自的发射峰值各不相同，但发射谱范围都有一定的重叠（图4-3）。为了保证仪器荧光检测的灵敏度，荧光测量的滤色片设计一般都有几十纳米的宽度。这样，在测量一种荧光信号的时候不可避免地会漏进部分相邻的荧光信号。这就是多荧光信号同时测量技术中荧光光谱重叠带来的麻烦。克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路。利用标准已知样品可合理设置荧光信号之间的相互补偿值，这样才能正确分析待测未知样品。有关荧光补偿技术的详细内容，将在FCM的质量控制章节进一步介绍。

五、FCM测量数据的存贮显示与分析

FCM定量测量细胞大群体中每一个细胞的多个参数。如果每一个细胞有五个测量参数，测量10000个细胞，就能获得50000个测量数据。如何保存、分析、提取这些数据中所包含的各种信息，在此我们将逐项加以讨论。

（一）FCM数据的存贮

在单参数细胞DNA测量中，过去都是由计算机软件进行数据分类，处理为一维数组方式，以DNA含量统计分布直方图显示和数据存贮。这种数据处理和存贮方式计算机内存占用少，显示直观。细胞双参数测量时，通常用二维的散点图方式显示，并使用二维数组矩阵的方式存贮为数据文件。数组和矩阵的存贮方式所记录的数据并不是原始测量数据，都已经过适当的加工处理。随着FCM三参数或三参数以上更多参数测量技术的发展，数据预处理变得复杂并常会丢失一些有用的信息。于是发展了list mode的数据存贮方式，目前已被广泛应用。List mode方式就是用列表的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件。它保存了测量过程中所有的信息，并且方便今后的数据加工、处理、显示和调阅等。`

(二)FCM数据的显示方式

list mode方式的数据文件保存了细胞样品测量过程中全部数据，包含的信息量大，并便于进一步的加工、处理、显示和调阅等。但它不是直观的图形，现已发展了多种图形显示软件可更直观地得其中包含的信息。

1．单参数直方图书的显示细胞每一个单参数的测量数据可整理为其统计分布，以分布直方图（distribution histogram）来显示（图4-4）。图中横轴为该测量参数的强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。图的纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数来表示。

图4-4A为一增殖细胞群体的细胞DNA含量分布直方图。可以看到图的较低道数上和较高道数上各一群DNA含量基本一致的细胞。位于高道数上的细胞DNA含量正好是位于低道数上的细胞DNA含量的2倍。在这两群细胞之间，还有一些DNA含量连续变化的细胞。同种非增殖细胞（静止期细胞，或称G₀细胞）的DNA含量分布直方图为单峰型，并且与增殖细胞群中的低DNA含量细胞峰道数一致。由此可知，增殖细胞群其DNA含量分布直分图的第一个峰是由其中的G₀/G₁细胞群组成，而第二个峰由为其G₂/M细胞群组成。两峰中间连续分布的区域由各阶段S期细胞群组成。从分布曲线各部分所占的面积就可直观地粗略了解各期细胞群在总群体中的比率，进而可以估计该群细胞的增殖活力等。在细胞DNA倍体分析等研究中，单参数DNA含量分布直方图可以直观提供样品中异倍体细胞群的存在及其细胞DNA含量偏异的程度等重要信息。在细胞膜表面抗原检测分析等研究中，从单参数荧光强度分布直方图上可以直接了解到阳性表达细胞群的存在及其多少，从阳性细胞群分布道数范围还可知道其抗原表达的强弱和高低，见图4-4B。

2．双参数数据的显示单参数直方图表示的是一个测量参数与细胞数量间的分布关系。细胞双参数测定不仅能提供两个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这两参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。

双参数数据显示最常用的是二维的散点图（dot plot）。在这二维图上，X轴代表第一个测量参数，Y轴代表第二个测量参数。图中每一个点代表一个细胞，此点的X坐标值为该细胞第一参数的含量，而其Y轴坐标值为该细胞第二参数的含量。图4-5是一增殖细胞群DNA与RNA双参数散点图。图中从细胞DNA含量的角度可以区分出G₁细胞群、S细胞群和G₂和M细胞群3个亚群。在G₁细胞群中可见其RNA含量有一定的离散程度，在S细胞群和G₂和M细胞群中同样可见到这种情况。从整个细胞群体观察，可见随细胞DNA含量增加，其细胞RNA含量也增加。但细胞DNA含量增加是在整个细胞周期中进行的，进一步观察，可见早S细胞的RNA含量与一部分G₁细胞相近，晚S细胞也与一部分G₂和M细胞相近。这种DNA与RNA双参数相关测量包含了大量的有价值的信息，它提示细胞RNA的生物合成在细胞周期的G₁期就开始进行。当G₁细胞的RNA含量达到一定值时才能进入S期。这就为区分早G₁期细胞和晚G₁期细胞提供了一个客观的指标。细胞进入S期后，其DNA倍增的过程中RNA继续其生物合成，但从DNA/RNA双参数分布的斜率可观察到细胞DNA合成速率高于其RNA合成速率。细胞从S期进入G₂期和M期后，DNA合成已停止但RNA的合成仍在进行，直到有足够的细胞RNA可分配到两个子细胞中去为止。各种不同组合的双参数散点图同样也可获得此两相关参数之间众多的有关信息。

双参数数据显示除散点图方式外还常用等高线轮廓图（contour display）和三维立体显示。图4-6为细胞DNA/BrdU双参数测量数据的等高线轮廓图。等高线轮廓图类似我们熟悉的等高线地图。在散点图上参数值相近或离散的细胞群表现为散点密集或稀疏，而在等高线轮廓图上可用不同颜色或标有细胞数的各种曲线轮廓来表示。轮廓线的水平变化可按线性分布，也可按对数分布。等高线轮廓图也可选择显示阈值或显示间隔等以去除一些背景碎片或充分揭示某些细节等。

双参数数据的三维立体显示其X、Y分别为两个不同的测量参数，而Z为细胞数，故有人称之为“假三维”显示。这种显示很直观，它与等高线轮廓图的关系类似于立体地形实图与等高线地图的关系。数值相近的各细胞群在三维立体显示中表现为一座座高低不等的“山峰”，立体显示有时会有立体重叠掩盖等情况。由于计算机软件的发展，现在可以方便地从任何不同立体角度显示同一双参数测量数据，来观察其中包含的每一个细节。实际工作中可同时利用散点图、等高线轮廓图和三维立体显示等全面反映细胞群体的组成情况。

3．多参数数据的显示随着FCM仪器和样品制备技术的发展，目前FCM仪器大多已采用list mode方式进行细胞多参数数据存贮。测量参数一般为5～8个，再加上细胞数目信息，要在单一图上同时显示这众多的参数是不可能。实际工作中，一般是用若干个单参数直方图和各种不同组合的双参数数据显示来全面反映一份标本中所包含的各种信息。多参数测量另一重要意义是通过有关参数进行“设门”分析。（gating analysis），可以是单参数设门，也可以是双参数设门。通过设门，圈定样品中的某一细胞亚群，再调出此细胞群的其他测量参数的有关信息。调出的信息同样也可以是单参数的或是双参数的。有人将从单参数设门调出双参数显示简称“一调二”。不难理解也有“一调一”、“二调一”和“二调二”等。例如，在细胞周期分析研究中，常用细胞前向散射信号和侧向散射信号双参数散点图提供的信息，双参数设门排除细胞碎片和细胞团块，从完整的单个细胞的群体中调出其细胞DNA含量分布直方图（二调一）；在细胞DNA荧光面积和荧光信号宽度双参数散点图上设门调出细胞DNA分布直方图右有效排除细胞双连体（）对G2/M细胞检测的干扰（二调一）；在外周血淋巴细胞亚群分析工作中，通过细胞前向、侧向散射光双参数散点图，识别并设门圈出淋巴细胞群体，再调出其各免疫荧光散点图进行来亚群分析（二调二）；在消化道上皮肿瘤细胞DNA倍体分析研究中，可用一个参数进行细胞角蛋白检测，并用角蛋白表达阳性来设门确定上皮组织来源的肿瘤细胞，避免肿瘤标本中大量浸润的淋巴细胞对DNA倍体分析的干扰（一调一）。多参数显示中还可以设二个或二个以上更多的“门”，并可利用这些门的“与”、“或”的逻辑关系，调出其他测量参数来显示。这种设门和调用已是FCM数据分析的重要技术。它对于排除各种因素对样品分析的干扰，获得准确的测量数据是必不可少的。同时这种技术对改进和简化样品制备步骤、减少样品制备过程带入的误差也起积极的作用。

六、FCM数据的分析

（一）单参数分布直方图的设区分析

这是单参数数据分析中最简单的一种方法。由于FCM一次测量的细胞数多，配合设门和调用等手段可获得感兴趣的细胞参数分布直方图。这种统计分布直方图一般可直观地反映出众多有用的信息。例如，在细胞表面抗原的分布直方图上可直接了解到是否有阳性表达细胞，该细胞表面抗原是高表达，还是低表达，阳性细胞与阴性细胞各占的比例等。在细胞凋亡检测中可观察到亚G₁细胞峰的出现及其在整个细胞群的比例等。但要得到准确可靠的数据，可用设区统计分析的方法，即在直方图X轴上（测量参数轴）确定若干区域的始末坐标值，分析软件就可显示和打印出各区域中细胞数目及所占百分比值，该参数测量平均值、中值、标准差和变异系数等统计数据。

（二）细胞DNA含量分布直方图的数据分析

通过细胞DNA含量的测定，了解细胞增殖群体中G₁、S、G₂和M期细胞各占的百分比例，进而分析细胞群体的增殖动力学各参数。这是FCM的重要应用之一。细胞DNA含量分布直方图的数据分析通常有两种方法，即作图分析法和计算机曲线拟合法（curve fitting）。

1．作图分析法细胞DNA含量分布曲线的作图分析法有S期细胞矩形法、G₁、G₂细胞峰折叠法等。S期细胞矩形法适用于S期细胞分布较均匀、S期细胞分布曲线段比较平坦的细胞群体；折叠法适用于S期细胞比例较少、S期细胞曲线段对G₁、G₂细胞正态分布曲线影响较小的场合。这些作图方法简便、快速，在早期FCM细胞动力学研究中起过重要的作用。由于其适用范围的限制，并且近年来计算机曲张拟合法的发展和完善，目前已很少使用。在此不再详细介绍它们各自具体计算方法与误差来源等。

2．计算机曲线拟合法细胞DNA含量直方图的计算机曲线拟合方法是根据增殖细胞群体DNA含量分布的生物学意义所设计的数学模型，利用计算机快速运算的能力，不断代入各参量，用最优化方法逼近实验曲线。常用的数学模型有Dean-Jett法、Fried法、Gray法等。现在还有各种商业软件可供选择。这些数学模型和应用软件的生物学依据包括以下一些内容：①G₁细胞为DNA二倍体细胞，所有G₁细胞DNA含量是一致的。由于荧光染色和测量过程中会带入一些随机误差，因此G₁细胞亚群的DNA含量分布曲线应为一个正态分布峰。②G₂/M细胞为DNA四倍体细胞，同样的理由，G₂/M细胞亚群也应为一正态峰，但其峰道数应恰为G₁峰的2倍。③S细胞群DNA含量分布应处于G₁峰与G₂/M峰之间并连续分布，或可被看作由很多小群细胞组成。每一小群代表了S期过程中的一个小阶段，在这个小阶段细胞的DNA含量基本一致，而小群与小群之间细胞DNA含量不断递增。

计算机拟合法适用范围大，现在已有可用于多克隆增殖细胞群体分析、同一细胞群体细胞增殖与细胞凋亡同时分析等软件。但实际应用中，还要注意以下一些方面：

（1）FCM仪器CV值与细胞荧光染色的好坏会直接影响曲线拟合的结果：一般的说，当CV值较小时，分析结果准确些，CV大时误差大，甚至无法分析。

（2）亚群：在细胞群体中数量较少的细胞亚群，如G2/M细胞群的分析误差一般大于细胞数量多的亚群。

（3）曲线拟合：曲线拟合有时会出现偏离生物学意义的分析结果。这种情况下，可改变参量或选用其他数学模型重新分析，并需要有经验的数据分析专家的参与。

应该指出的是，通过测定细胞DNA含量进行细胞动力学分析的方法尽管方便快速，但仍存在一些缺陷。首先，从细胞DNA含量出发在DNA二倍体细胞群体中是无法区分G1细胞与G0细胞的，同样在DNA四倍体细胞群体中也无法区分G2细胞与M细胞；第二，G0/G1%、S%和G2/M%这些数据是由计算机软件依据一定的数学模型对实验曲线处理而获得的，也即并不是直接测得的，有时误差会较大。因此，人们不断努力寻求新的细胞样品制备方法，如细胞DNA变性处理的吖啶橙染色法，又如溴化脱氧尿嘧啶核苷掺入法等，以直接标记细胞群体中S群细胞和M期细胞等，可获得更准确更丰富的细胞增殖动力学参数。

（三）双参数测量数据的设门分区分析

在双参数测量的散点图上，细胞结构和细胞功能相同的同一细胞亚群总表现为一种集中分布的趋势；一个样品中不同细胞亚群有其各自的分布区域。这样就很容易用设门分区的方法将各细胞亚群分别圈出后进行仔细的数据处理，主要包括各亚群细胞所占的百分比，每一亚群细胞的参数X和参数Y的均值、标准差、变异系数等。从这些基本信息就可进行深入的分析研究。设门分区可以是方形、矩形、圆形、椭圆形甚至各种不规则图形，按细胞亚群实际的分布情况而定。

（四）多参数测量数据的分析

多参数测量数据分析的关键在于如何正确通过设门和调用获取有价值的单参数显示和（或）双参数显示。由于多参数相关测量的数据中包含的信息量大，故经常需用多个单参数和（或）双参数显示来全面反映其中的各种意义。实际工作中，由于样本细胞种类、处理过程、染色方法等各方面的差异，不可能规定不变的数据处理步骤。但是，多参数测量数据分析是整个实验工作的十分重要的一环，在实验设计中就应给予认真的考虑与设计。这一点对于每一位分析细胞学的研究工作者来说，必须给予足够的重视。细致认真的数据处理可获得大量的正确的结果。相反，粗糙的、随意的数据处理将导致错误的结论，并可能将研究工作引入歧途。

七、FCM的质量控制

（一）FCM分析的质量控制

由于流式细胞仪是一较复杂的系统，属技术密集性的仪器。仪器各部分的性能如稍有改变都会影响整个仪器的测量灵敏度、分辨率及稳定性。为了保证获得准确的测试分析结果并使样品与样品、不同日期测量的结果之间乃至不同实验室之间的研究工作可以直接加以比较，流式细胞仪实验室必须进行必要的质量控制（quality control,简称QC）。一般包括以下几个方面。

１．FCM仪器的核准与标准化　　标准荧光微球和戊二醛固定的鸡血细胞是最常用的参考标准。市售有各种不同用途的、体积大小各异、荧光素品种和含量不同的标准荧光微球、其中体积和荧光素高度一致的标准微球（其各指标的标准差CV值在１％以下）是用于仪器校准的理想材料。荧光微球悬浮好，性能稳定并易保存。在相同的仪器条件下，如光学校准、液流稳定、光电倍增管增益固定、同样的分束片与滤色片等，同批号的荧光微球获得相同的信号强度（即相同的道数）和相同的CV值。实际工作中，通过不断观察荧光微球信号和CV值的变化情况，可将FCM仪器光学校准调（optical alignment）至最佳状态。

一般情况下仪器调至最佳状态后即可进行细胞荧光的相对测量。而在某些需要进行荧光绝对强度（如受体定量）测量的场合，则有必要通过调节电倍增管的高压或放大器增益等将标准信号固定在一定的道数上，再进行样品的测量。这就是仪器的标准化。

2．荥光染色的标准化在细胞DNA含量测定等工作中，一般在被测样品中加入少量（约5%）的新鲜鸡红血细胞（CRBC）或鳟鱼血细胞（TRBC）。由于这两种红细胞都有核，属终末分化细胞，其DNA含量恒定。并且一般在FCM的细胞DNA含量分布图上与哺乳类动物细胞的DNA分布是各自分开的，相互不干扰。它们作为内插的生物标准用于检查荧光染色试剂和染色过程。正常的情况下，在细胞DNA含量分布图上鸡红血细胞或鳟鱼红血细胞的DNA分布峰出现在较低的道数上，并有固定的道数位置和固定的CV值。它们可还用作监视整个FCM分析过程中的问题都会反映在已知内插生物标准的分析结果上。

3．FCM检测细胞DNA倍体的标准分离纯化的正常人外周血淋巴细胞是最常用的DNA分析和DNA异倍体(DNA aneuploid，简称DA)检测的参照物。如有可能，在恶性肿瘤细胞DA检测工作中推荐利用同样组织来源的正常细胞作为二倍体（2C）的标准。

4．免疫荧光研究中的对照 FCM免疫荧光定量分析工作中常受到非特异结合荧光的干扰。目前一般采用已知阳性细胞和阴性细胞作对照。也可利用同型的无关抗体来排斥免疫荧光染色中的非特异结合（如Fc段结合反应等）。用非荧光标记的抗Fc受体抗体进行封闭，增加反应体系中蛋白质的浓度（如加入某些动物的血清）或改变离子浓度也可减弱荧光抗体与细胞之间的非特异性结合。实际工作中，常先用同型免疫球蛋白（isotype）替代特异抗体，测得阴性染色对照的非特异荧光值，再作样品测试并计算出阳性表达率。

细胞的自发荧光有时也会干扰测量分析的结果。只要先测一次未经染色的细胞，就可确定自发荧光应扣除的值。样品中的死细胞又是另一个问题。因为荧光抗体可非特异地进入死细胞的胞浆。实际工作中，应在FCM分析前先用锥兰排斥试验了解样品中细胞的活力。也可用DNA酶处理移去死细胞，或用密度梯度离心法去除死细胞，或可使用碘化丙啶（PI）染料对死细胞核染色再通过“设门”分析，排除死细胞对数据分析的影响。

5．荧光或多荧光FCM分析中的荧光色标定 FCM多荧光信号分析目前大多使用同一激光光源。在这种情况下，接受细胞不同荧光信号的各光电倍增管是在同一时间内和从同一空间位置收到信号的，因此不可能利用时间条件或空间滤波器等方法来排除多信号相互之间的干扰。常用的方法是利用光学分束片和滤色片的各种组合将不同的荧光信号分别送入各自的检测器。然而，目前使用的荧光素都是宽发射谱的，相互之间有明显的重叠部分。分束片和滤色片等光学元件不能完全解决这些问题。实际工作中，常用的方法是利用电子技术工计算机软件等方法将串入相邻荧乐通道的部分信号加以扣除。这种技术称为“荧光补偿”（fluorescence compensation）。每次设置荧光补偿时，可先单独用各种荧光素对细胞染色，进行FCM测试，分别确定各自的补偿量，然后再进行细胞多荧光FCM分析。这类工作中要注意的是，如果各荧光通道的增益改变或更换了其他分束片、滤色片等光学元件，整个荧光补偿设置过程必须重复一次。

在多激光FCM系统，来自不同激光所激发的细胞荧光信号可以利用空间滤波器或时间序次电子学方法等到加以解决。

FCM分析术质控中众多的调试、测试、对照、标准及标定等都应逐日进行详细的记录，作为实验室质控的一部分。定期检查这些资料还能发现一些问题并及时加以排除，保证FCM测量分析结果的准确性。

（二）FCM分选的质量控制

由于FCM分选是在FCM分析的基础上进行的，因此FCM分析的质控对FCM分选是同样重要的。同时，FCM分选的纯度指标对分选后的进一步研究至关重要，必须给予特别的重视。

FCM分选所得的细胞一般数量较少，一般不再用于再次FCM分析以确定其纯度。因此，实际工作中，一般要利用两种或两种以上的标准微球或生物细胞的混合样品先进行分选，来确定每台FCM仪器分选延迟时间的误差和各种不同分选条件对分选纯度的影响。每一FCM实验室都必须进行这些分选的前期准备工作，以确定最佳分选条件。以后每次分选工作中，一般还应先用样品在最佳条件下进行分选，并用分选所得的样品再作FCM分析，观察其纯度。只有在标准样品的分选可达到分选纯度指标的情况下，才可进行实验样品的分选纯化。

八、FCM白血病细胞免疫表型诊断

FCM分析术与分选术在医学生物学的各领域中已有广泛的应用。它的研究对象是各种类型的细胞，可以是各种正常的细胞，也可以是各种不同的异常细胞。血液学是研究造血组织、血细胞发生以及血液功能等的一门综合的学科，涉及到细胞生物学、免疫学、细胞遗传学、肿瘤学等多个生物学领域。体内血细胞动力学又与造血细胞的增殖、各系血细胞的分化、细胞凋亡及其相互之间产关联与平衡密切相关。由于血液、骨髓等标本采集比较方便，又可反复取样，样品中各种细胞成分呈分散悬浮状态，很适合FCM分析分选等研究，因而血液学是FCM技术首先的重要的应用领域。

随着细胞荧光染色技术的发展和完善，越来越多的细胞生物学参数和细胞的各种化学成分都有其相应的定量荧光染色方法。以往细胞学多常用的同位素标记技术，酶标技术等也都有相应的荧光标记方法可用于FCM测试分析。荧光标记方法与以往一些染色方法相比，具有灵敏度高，操作制备周期时间短，并可方便地在同一细胞样品上进行多色荧光染色供荧光多参数分析及其定量测定。其缺点主要是制备后的标本不易长期保存。

利用细胞表面抗原检查来进行细胞分类是从发现T、B淋巴细胞开始的。细胞免疫表型分析以往受到多价抗体反应交叉性和显微镜下肉眼观察判断存在一定的主观性等的限制而难以进一步发展。20世纪70年代开始FCM技术和单克隆抗体技术几乎在同一时期内发展成熟，这使细胞免疫表型的分析研究得到了迅速的发展。目前，除T、B淋巴细胞及其各功能亚群分类外，单核细胞、粒细胞、吞噬细胞、骨髓干/祖细胞、各系各分化阶段的造血细胞以及各种活化细胞、异常细胞和肿瘤细胞等都可以通过细胞膜抗原检查，即细胞标志物（cell markers）检查加以分析鉴定。随着免疫学与单克隆抗体研究工作的进展，到目前为止，CD系列单克隆抗体已发展到近170种。其中按反应特性又可分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、血小板、骨髓细胞、内皮细胞、粘附分子、活化细胞标志、细胞因子等几大类。

正常造血细胞发育过程中各系血细胞的各个分化阶段细胞膜的免疫表型变化已有大量研究。这些细胞膜上的各种抗原在造血细胞分化成熟过程的不同阶段或出现或消失，或表达增强，或表达下降。这些变化都遵循一定的规律。进一步的深入研究表明，这些抗原都是具有一定生物学功能的效应分子，它们参与造血细胞发育成熟过程中的免疫应答和调控作用。

众所周知，白血病分类诊断是选择治疗方案和判断预后的重要依据。临床上一般采用FAB分类法。FAB法主要依赖血液病理学家对白血病细胞的形态学观察和细胞化学反应，其确诊急淋（ALL）和急非淋（ANLL）的符合率可达95%以上，而各亚型的诊断符合率仅60%～80%，因而难以预测预后和危险因素。随着单克隆抗体标记技术与FCM细胞多参数分析技术的发展，现已可对白血病的发病机制以及各亚型分类、甚至一些特殊的类型（如双表型白血病、双细胞系白血病等）有了进一步的了解和认识。

白血病的细胞学主要表现为骨髓造血细胞分化成熟受阻和增殖异常，长期以来主要通过骨髓细胞涂片的形态学检查和细胞化学等方法进行诊断。然而，其中20%～30%病例由于细胞形态学表现不典型、细胞发育幼稚等而难以明确诊断和分型。我们知道，白血病治疗方案的选择，治疗效果和预后等是与其诊断分型密切相关的。FCM白血病细胞免疫表型分析可以快速精确分析白血病异常细胞的系来源及其分化阶段，这称为FCM白血病细胞免疫表型诊断。它与细胞形态学检查、细胞遗传学检验以及分子生物学检查结合在一起（MICM），可以较准确地对各类各型白血病进行诊断，以便正确选择治疗方案，以获得更高的缓解率和更好的临床效果。

细胞免疫表型分析随着单克隆抗体直接荧光标记技术和荧光素化学技术的发展，已从细胞单个参数标记发展到双荧江双参数标记、三荧光三参数标记甚至更多参数的标记分析。这些技术的发展，不仅大大提高了FCM分析工作的效率，更重要的是它可以检出同一细胞不同抗原的共同表达（co-expression）和它们之间的相互关系。近年发展的CD45/SSC双参数细胞亚群分布定位结合细胞多荧光分析方法可以较仔细研究骨髓和外周血标本中各类细胞的免疫表型（图4-7）。并且这类多参数分析工作已发展到细胞表面抗原、胞浆内特异抗原、核内抗原或特异核酸序列等的同时检测，使研究同一细胞的免疫表型与其细胞功能，或细胞表型与其细胞核型等之间的相互关系成为可能，这些多参数分析工作将会有很好的应用前景。

目前根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原，将白血病细胞分为B细胞系（CD19，CD20），T细胞系（CD7，CD3），髓细胞系（CD13，CD33）以及红细胞系（Glycophorin A）和巨核细胞系（CD61）等。这就是白血病的细胞免疫表型分类。用这种方法可明确约98%急性白血病病人的白血病细胞和种系，并可探明慢粒急变时的白血病细胞来源。在白血病细胞双参数或多参数免疫表型的分析研究中，发现幼稚的白血病细胞免疫表型有时会出现与正常

造血细胞幼稚阶段不同的异常表现，如在同一白血病细胞膜上可同时检出造血细胞早期分化标记（如CD34等）和某些晚期分化标记物（如CD20、CD22等）；有时在同一白血病细胞膜

上可同时检出淋巴细胞系的特异抗原和髓细胞系的特异抗原；也有在淋巴细胞性白血病的细胞膜上同时检出T细胞和B细胞的各种特异抗原。这称为白血病细胞“双表型”现象（biphenotype），这说明白血病细胞作为一种造血系统恶性疾病，其异常的细胞分化程序与正常造血细胞有明显的不同，这种现象也被称“发育不同步”（developmental asynchronous）和系列不保真性（lineage infidelity）。还有少数白血病其细胞仅表达Class,TdT，CD34，CD7等早期抗原，缺乏CD13，CD33，CD22，CD19，CD3，Glycophorin A和CD61等系特异分化抗原表达。这说明其来源于无分化潜力的非定向干细胞克隆。

现在已知，白血病患者体内的白血病细胞来源于突变的异常造血干细胞，其细胞遗传学检查可检出特定的染色体异常表现。这种由细胞遗传学改变而致的分化过程中基因表达的异常，带来细胞功能和细胞表型等一系列的异常。白血病细胞免疫表型异常或“双表型”、“双细胞系”等的检出还有其重要的临床意义。在白血病的化疗中，30%左右的病例治疗效果很差，称“难治型白血病”。进一步的研究发现其中一部分病例的白血病细胞为“双表型”。另外，通过细胞膜抗原检查，还可以发现多药耐药性白血病细胞群和微小残余白血病细胞群等。这些特殊细胞免疫表型的白血病一般用常规治疗方案难以获得较好的疗效。检出这些特殊类型的病例对其临床治疗有指导意义。综合不同治疗方案的优点，发展新的治疗方案，力争各种亚型白血病都能获得较高的缓解率，也是当前白血病临床治疗的重要研究课题之一。

第四章完

2003年8月7日星期四

四、细胞信号的检测与分析

被测样品中的细胞流经仪器检测区时受到激发光的照射。激发光与细胞相互作用后可产生散射光信号和荧光信号。

（一）细胞散射光信号

（二）细胞的荧光信号

五、FCM测量数据的存贮显示与分析

（一）FCM数据的存贮

(二)FCM数据的显示方式

六、FCM数据的分析

（一）单参数分布直方图的设区分析

（二）细胞DNA含量分布直方图的数据分析

（1）FCM仪器CV值与细胞荧光染色的好坏会直接影响曲线拟合的结果：一般的说，当CV值较小时，分析结果准确些，CV大时误差大，甚至无法分析。

（2）亚群：在细胞群体中数量较少的细胞亚群，如G2/M细胞群的分析误差一般大于细胞数量多的亚群。

（三）双参数测量数据的设门分区分析

（四）多参数测量数据的分析

七、FCM的质量控制

（一）FCM分析的质量控制

在多激光FCM系统，来自不同激光所激发的细胞荧光信号可以利用空间滤波器或时间序次电子学方法等到加以解决。

（二）FCM分选的质量控制

八、FCM白血病细胞免疫表型诊断

第四章完

2003年8月7日星期四

第六章

白血病分子生物学（顾柏伟）

第一节白血病的分子机制

尽管白血病的发病机制，尚未阐明，但越来越多的资料表明白血病是一个复杂的多基因病。为了理解白血病的病因，发病机制各种生理、生化病理、免疫等方面的异常及临床表现，也为了进行准确的诊断和治疗，掌握分子生物学有关基础知识、技术及白血病分子生物学研究进展是非常必要的。

一、基因概述

基因（gene）存在于染色体上，其基本结构是DNA的双螺旋结构，是涉及某种蛋白质或酶的遗传上的基本功能单位。基因的分子生物学定义是：一个基因应该是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。按照这个定义，一个基因应包含不仅是编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列、5′端非翻译序列、内含子以及3′端非翻译序列等所有的核酸序列。

二、癌基因和白血病

癌基因是指细胞或病毒中存在的、能诱导正常细胞转化、并使之获得新生物特征的基因。通常将病毒中的这类癌基因称为病毒癌基因（V-ONC），细胞中存在的癌基因称为细胞癌基因（C-ONC），由于C-ONC在正常细胞中以非激活状态存在，故又称为原癌基因（proto-ONC）。

原癌基因是细胞基因级DNA的正常成员，通过编码生长因子、生长因子受体、细胞内信息分子及转录调节因子等参与细胞增殖和分化的调控。原癌基因在化学、物理、生物等致癌因素的作用下，通过点突变、染色体重排、基因扩增等途径引起结构或调控异常，从而具有致癌活性。

癌基因活化的方式：

1．点突变基因在编码顺序位置上1个或几个核苷酸发生顺序改变称为点突变。

2．染色体重排原癌基因活化的染色体重排有4种类型：染色体基因易位（指基因从一条染色体位置转至另一条染色体位置，涉及的基因相互易位，染色体物质既无增加，也不丢失）；基因插入（指外源基因的引入，属不平稳易位）；基因丢失（指特定位点染色体基因丢失，也是平稳易位中的一种）。在这4种情况中，最多见的癌基因激活方式是基因易位。染色体是基因高度密集和有序排列的场所，原癌基因从染色体上正常位置转至另一染色体的某一位置上，导致其基因调控环境表达的改变。典型的例证是t（9；22）易位引起两种新的融合基因BCR/ABL和ABL/BCR，可引起CML和ALL。

3．基因扩增基因扩增是指细胞内一些基因内一些基因通过不明机制复制成多个拷贝数。基因扩增可导致蛋白的产物增加，使细胞正常功能受到干扰。现已发现在许多白血病中有癌基因扩增，如AML细胞系HL60和KY821有C-myc的放大，CML细胞系K562有4～8倍的C-all扩增。

三、抑癌基因和白血病

（一）抑癌基因（tumor suppressor genes）

是指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控作用，并能潜在抑制细胞的恶变。

（二）抑癌基因抑癌的证据

体细胞杂交研究间接提示正常细胞也存在抑癌基因，把癌细胞系和正常二倍体细胞进行杂交，融合细胞一般失去癌基因的恶性表型，接种到适当的宿主后也不再长瘤。目前通过先进的微细胞融合技术可以把某一条正常染色体转入某个恶性细胞系，直接证实了正常染色体可抑制恶性表型，使恶性细胞分化凋亡。

（三）抑癌基因的种类（表6-1）

抑癌基因	染色体缺失部位	主要相关的肿瘤
RB	13q14	视网膜母细胞瘤，骨肉瘤
P53	17p13.1	小细胞肺癌，结肠癌，白血病
WT1	11p13	Wilms瘤
DCC	18q21	结肠直肠癌
NF1	17q11.2	神经纤维瘤
MCC	5q21-22	结肠癌
MEN-1	11q23	副甲状腺瘤
RA1	?	纤维母细胞瘤
PTP	3q21	肾细胞癌
APC	5q21	结肠癌，肺癌

（四）抑癌基因的主要功能

目前已明确抑癌基因的主要功能有9个：诱导终止分化、维持基因稳定、触发衰老、诱导细胞凋亡、调节细胞生长、负性生长因子的信号传导、抑制蛋白酶活性、改变DNA甲基化酶活性、调节组织相容性抗原、调节血管生成、促进细胞间联系。

（五）现在人们已在多种白血病中发现抑癌基因的失活现象

如Rb和P53基因

1．R基因的主要失活方式有缺失、突变、甲基化、表达失活以及与细胞和病毒癌蛋白结合引起功能性失活。各型白血病均可见Rb基因失活，发生率10%～30%，急性白血病较慢性白血病和淋巴瘤多见。一般认为Rb的失活与白血病加剧的关系较发病的关系更为密切。

2．P53基因功能的丢失主要是基因错义点突变。近年来发现白血病和淋巴瘤也有P53基因改变，总的来说，P53基因突变多见于白血病的进展期及其体外培养的细胞株，因此多认为P53基因突变与白血病的急变、病情进展密切相关。

四、凋亡和白血病

死亡是生命的自然规律，当细胞不能按一定程序死亡时就能发生肿瘤，也就是说肿瘤可能是细胞该死而未死的后果。这是近几年研究的初步结论。它为包括白血病在内的癌症研究提供了一个全新的概念。以前，人们研究白血病时，注意力几乎全部集中在细胞内部控制细胞分裂、增殖的通路上，认为增殖失调是白血病发生的原因。但现在的研究表明，白血病细胞也有控制其何时死亡的内部通路，只是这个通路受到了抑制，致使细胞寿命延长，典型的例子是CML和APL，APL已被证实利用促进细胞分化的药物如维A酸可以使细胞成熟分化，达到控制疾病的目的。

凋亡（apoptosis）是一种编序的细胞死亡（programmed cell death）；是在基因控制下细胞的主动死亡，在形态上具有与坏死不同的特征。现在已知有很多基因参与了凋亡的调节。大致可以分为两类：一类是细胞死亡遗传学（genetic of apoptosis）相关基因；另一类是与细胞死亡相关的癌基因、抑癌基因和病毒基因。本书的其他章节将具体介绍凋亡的分子机制。

第二节基因操作的基本技术和应用范围

一、人染色体DNA的制备

DNA以核蛋白形式存在于细胞核中，制备DNA的关键是既要非DNA物质如蛋白质、脂类、糖类、RNA等分离干净，又要保持DNA分子的完整性。通常是在有EDTA、SDS存在下用蛋白酶K释放出细胞中的核酸，随后用酚或氯仿抽提而实现的，最后用Rnase A去掉RNA。以下简单介绍红细胞裂解法：

（一）试剂配制

红细胞裂解液：10mM Tris-HCl(pH7.8)，5mM MgCl₂，10mMNaCl

白细胞裂解液：1mM Tris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA，0.17%SDS

（二）操作方法

1．取5～10ml肝素化血（约20U肝素/ml），加3倍体积的红细胞裂解液30ml混匀；

2．3000r/min离心5min，弃上清液，再加30ml红细胞裂解液。

3．3000r/min离心5min，弃上清液，把沉淀的白细胞轻摇分散，逐滴加入3～5ml白细胞裂解液和蛋白酶K，使蛋白酶K的终浓度为200μg/ml，37℃轻摇4h或过夜。

4．加等体积苯酚-氯仿（3：1）的混合液，轻摇5～10min，2500r/min离心10min，吸取上层水相，并重复1～2次。

5．加2.5倍体积的无水乙醇和1/20体积的3mM的NaCl，摇匀后得到白色的絮状DNA沉淀，用玻璃棒捞起DNA，用70%乙醇洗涤1～2次后空气干燥。

6．将DNA溶解在TE中。

二、人总RNA的制备

从组织或细胞中分离RNA的方法很多，目前以酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的应用最为广泛。一个典型的哺乳动物细胞约含10pgRNA，其中80%～85%为rRNA（主要是28S，18S和5S），其余15%～20%是低分子量RNA如tRNA，mRNA为总RNA的1%～5%。

以下介绍异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法抽提总RNA。

（一）试剂配制

1．变性溶液（D液）

4mol/L异硫氰酸胍（分子量118.2）；

25mmol/L柠檬酸钠（pH7.0）；

0.5%十二烷基-N-甲基甘酸钠；

0.1mol/Lβ-硫基乙醇。

例如配制100mlD步骤如下液：

（1）称取异硫氰酸胍50g，加DEPC水50ml，先溶解（体积约增至90ml）。

（2）依次加入1M柠檬酸钠2.5ml，35% Sarcosyl 1.44ml，补充体积至100ml。

（3）高压，15～20磅，15～20min。

（4）高压后加入β-硫基乙醇0.72ml。

（5）保存：室温，避光，1～3个月

2．2M乙酸钠，pH4.0（分子量82.03）

称取82.03克乙酸钠溶解于500ml水中，调pH至4.0，用0.1%DEPC水处理。

3．苯酚用DEPC水平衡重蒸苯酚，置4℃，避光。

4．氯仿-异戊醇 49：1混匀。

5．异丙醇

6．TES溶液 Tris-EDTA（10mM：1mM）/0.2%SDS。

（1）称取Tris（分子量121.14）24.22g，溶解于100ml水中，即为2M，调pH为8.0。

（2）称取EDTA（分子量372.24）14.89g，溶解于100ml水中，即为0.4M，调pH为8.0

（3）称取SDS（分子量288.38）10g，溶解于100ml水中，即为10%SDS。

（4）取2M Tris 0.5ml；0.4M EDTA 0.25ml；10% SDS 2ml；将水补充至100ml，混匀，4℃保存。

7．DEPC水 1000ml水中加1ml DEPC，摇匀，置37℃温箱，过夜；次日，高压15～20磅，15～20min，置4℃冰箱保存。

（二）抽提细胞总RNA步骤

1．从-80℃或液氮取出保存的冷冻细胞，立即置于冰中。

2．用3～5ml细胞裂解液（D液）溶解冷冻细胞，移于50ml离心管，再加入等量（3～5ml）苯酚溶液，1/10量（0.3～0.5ml）乙酸钠，1/5量（0.6～1ml）氯仿-异戊醇（49：1）混合液，振摇10s，置冰浴15min。4℃离心，10000r/min，20min。

3．用1000μl加样器吸出上层水相至新的50ml塑料管中（切忌吸出下层蛋白及DNA），弃下层。

4．加等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃沉淀1h以上。

5．4℃离心，10000r/min，20min。

6．弃上清，沉淀物溶解于0.5mlD液中，移至1.5ml eppendorf管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃，再次沉淀1h以上。

7．4℃离心，10000r/min，20min。

8．弃上清，沉淀物用200μl TES溶液溶解，加20μl乙酸钠（2M），双倍体积（440μl）无水乙醇，摇匀，置-80℃冰箱，20～30min。

9．4℃离心，10000r/min，20min。

10．弃上清，沉淀（RNA）经真空干燥，溶于20～50μl DEPC水中，置-80℃冰霜，待用。

（三）RNA浓度定量

用分光光度法测定，在260nm和280nm两个波长下读数，在260nm的读数用于计算样品中的核酸浓度，OD值为1相当于40μg/ml的RNA。

估计样品纯度：纯度取决于OD₂₆₀与OD₂₈₀比值，若比值接近2，说明光吸收主要由于核酸，即RNA较纯；若比值＜1.6，说明样品中含蛋白质或酚等其他吸收紫外光的杂质，建议重新抽提沉淀。

浓度测定后，可根据需要，取少量RNA样品，用DEPC水稀释至0.1～0.5μg/μl，以备RT-PCR反应用。

为了获得高质量的细胞RNA，必须使用RNA酶的抑制剂，及采用破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性，同时避免偶然引入实验室内其他潜在的微量RNA酶也很重要，下面列举避免RNA酶污染的一些注意事项。

1．灭菌的一次性塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。

2．实验室用的普通玻璃器皿须经250℃干烤4h。

3．塑料制品用0.1%DEPC水溶解浸泡，37℃放置12h以上，然后用灭菌DEPC水洗涤数次，最后15磅高压灭菌15min。

4．DEPC可通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰，因此最后须高压除去DEPC。

5．实验过程中一定要戴手套并勤换手套。

6．用高压灭菌的水和RNA专用试剂配制溶液，用干烤过的药勺称试剂，将溶液装入250℃干烤的玻璃器皿，尽可能用0.1%DEPC水配制溶液，然后37℃处理12h以上，然后高压15磅，15min，个别不能用DEPC处理的试剂（如Tris一类缓冲液，DEPC可与胺类迅速发生化学反应），可用新的未开封的试剂，用高压过的DEPC水配制。

三、逆转录反应

逆转录反应是指以RNA为模板，NTP为底物，寡核苷酸为引物，在反转录酶的催化下合成与RNA模板互补的DNA（DNA，第一链）。RNA链随即被反转录酶水解，在以DNA第一链为模板合成另一条互补DNA链（DNA第二链）。

四、Southern印迹杂交

Southern印迹杂交是具有一定互补顺序单链在液相或固相体系中按碱基配对原则结合而成异源双链的过程。1975年发现了利用浓盐溶液的推动作用将变性单链DNA转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上的方法，转移后的膜与同位素标记的DNA探针杂交。

（一）操作步骤

1．样品DNA被限制性内切酶酶解。

2．DNA酶解片段的琼脂糖凝胶电泳分离。

3．DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维膜或尼龙膜。

4．探针的标记。

5．探针与膜上的DNA片段进行杂交。

6．放射自显影，分析结果。

（二）应用

1．基因结构和表达的分析如，检测基因的甲基化程度、比较不同组织在不同发育分化时期中某个基因的表达情况、分析癌基因的扩增情况、白血病中各种不同类型融合基因的基因重排情况等。

2．疾病的分析诊断如镰刀状红细胞性贫血、α₁-胰蛋白酶缺陷、生长激素缺乏症I-A型、用RFLP分析遗传性疾病等。

五、普通凝胶电泳技术

凝胶电泳是分离、鉴定、纯化和制备DNA最常用的方法，有两类：一类是琼脂糖凝胶电泳，另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳。DNA在pH8.0时带负电荷，在直流电场中泳向阳极。分子小者泳动快，分子大者泳动慢。每次电泳以乙知分子量的DNA片段作为标准，电泳后溴乙锭染色，在UV灯下即可测量、判断出各片段的大小和位置。

六、聚合酶链反应

（一）聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种酶促反应，模拟天然DNA的复制过程的体外扩增法。根据待测基因的序列即可合成一对与两条靶序列互补的寡核苷酸引物，在耐热的Taq DNA Polymerase的作用下，经过20～40个“变性-复性-延伸”的循环，可使两寡核苷酸引物之间的特异序列得到上百万倍的扩增。

首先，根据所要扩增的DNA序列，设计合成两个20个核苷酸左右的寡核苷酸引物。这两个引物的序列分别与靶基因DNA两条链的两侧序列互补。注意，两个引物都结合在DNA两条链的3′端，因此其中一条引物的顺序与DNA（+）链的5′端顺序一致，而另一条引物的顺序与DNA（+）链的3′端顺序互补。

然后，在PCR试管中加入：含MgCl₂的PCR反应缓冲液、两条引物、4种三磷酸脱氧核苷酸dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、Taq DNA聚合酶、模板DNA。接下去，就进行三温PCR循环：

1．变性（denaturation）一般在95℃左右。在此温度下模板DNA及以后新合成的DNA双链都变性成为单链，这一步一般只需30s到1min。

2．退火（annealing）一般在55℃左右，这时候寡核苷酸引物就特异地结合到变性后的DNA链上，如需要提高扩增片段的特异性，可适当提高退火温度，但有时会减少扩增产物，因此视不同的基因片段和引物而调节退火温度。这一步也只需30s到1min。

3．延伸（extension） DNA聚合酶根据DNA模板的顺序，在引物3′端接上一个三磷酸脱氧核苷酸，从而使新合成的互补链不断延伸。新合成的链在第一次循环时可能长短不一，但以后的PCＲ循环就使新合成的产物绝大多数位于两条引物之间。PCR产物一般为几百个bp，但长的可有几十个kb。这一步的温度为72℃，时间为1～2min。如果需要合成长片段则可适当延长时间。最初用于这一步的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，因其不耐热，在DNA变性时就可被灭活，因此每次延伸时就必须添加新鲜的Klenow片段。以后从嗜热细菌Thermus aquaticus中提纯得到热稳定的DNA聚合酶，简称Taq DNA聚合酶。这种酶的最适反应温度在72℃左右。而在95℃的变性温度下也保持活性，从而使整个PCR反应只需要加一次酶，大大简化了PCR反应的操作步骤，并使PCR反应自动成为可能。

在进行上述三步的一个PCR循环后，DNA片段就增加1倍。以后随着PCR循环进行下去，DNA分子数就呈指数增长，即2ⁿ（n为循环次数）。从理论上讲，1个DNA分子经过25次PCR循环后就可以扩增到3000万倍以上，但在实际反应时，由于底物的减少、产物的增加、产物本身复性等各种“停滞效应”，PCR反应到达一定水平时就会以线性形式而非指数形式扩增。即使这样，在25次PCR循环后，一个DNA分子也可扩增几十万倍到上百万倍，足够用于各种检测。

（二）PCR的特点

1．简便样品DNA不需很纯，甚至不必提取DNA，直接用溶解的白细胞、羊水细胞等进行DNA扩增。

2．特异 PCR的特异程度很高，只要选择特异性高的引物对，就可获得满意的扩增结果。

3．灵敏 0.1μg以下的DNA样品足够用于PCR，甚至单个淋巴细胞都可作PCR扩增。

4．不需基因探针在其他基因诊断方法中，应用标记的探针是基本的手段，但在PCR中，由于样品DNA已扩增至上百万倍，使原来必须用特异基因的探针才能检测到的信号变成肉眼可见的信号，通过电泳分离就可以直接观察到检测的DNA序列。

5．快速应用PCR技术，只需几天甚至几小时就可获得结果。

可应用RT/PCR技术来研究基因转录产物。

（三）PCR相关技术的发展

1．筑巢式PCR（nested PCR）首先用一对引物进行PCR扩增，然后用所扩增的DNA片段内侧的第2对引物进行第2次PCR反应。用这种方法得到的PCR产物得率高，并仅限于第2对引物扩增的范围，因而可以明显提高反应的特异性，增加扩增效率。

2．多重PCR（multiplex PCR）有时可以应用多对引物同时扩增一个基因中的几个不同DNA片段，亦可同时用于扩增不同基因的几个DNA片段，但所设计的引物对必须有非常接近的退火温度，如果两对引物间的Tm值相差悬殊，可引起扩增产物量的差别，常可见其中一个引物对无明显的扩增产物。此外，靶基因DNA的扩增长度也必须相类似，否则较短的靶基因DNA的扩增效率明显优于扩增片段较长的DNA。因此，为了取得相同的扩增效率，必须调节各引物对之间的Tm值和PCR扩增产物的长度以及各引物对的量。

3．不对称PCR（asymmetric PCR）所谓不对称PCR是指用两个不同浓度的引物进行PCR反应，典型的引物浓度的比例是50：1～100：1，在开始的15～20个PCR循环，所产生的大多数产物是双链DNA，以后由于其中一条引物浓度受到限制而使单链DNA的数量直线增加。用不对称PCR可以直接制备DNA模板，进行核苷酸顺序分析或减数cDNA的分析。

4．反向PCR（reverse PCR）反向PCR可以合成基因外侧，而不是其内侧的DNA序列。靶DNA在扩增前用限制性内切酶酶切，然后用DNA连接酶连接，形成环状，反向PCR引物的方向的相反的，因此可以扩增引物的上游和下游区域，用这种方法制备的探针可用于大片段DNA的克隆。如酵母人工染色体，这些探针可用于基因文库的染色体步移，测定转座子的插入顺序以及定点突变（Site-directed Mutagenesis）。然而反向PCR具有一定的局限性，首先，需要扩增的DNA顺序是未知的，因此很难选择适当的限制性内切酶。此外，用反向PCR方法所获得的探针常含有重复序列。

5．挂靠PCR（anchored PCR）挂靠PCR用于分析基因末端的顺序。首先，合成cDNA，然后在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的作用下，在3′端加上poly(dG），再根据3′端已知的核苷酸顺序和cDNA加尾处（anchor）设计两对筑巢式引物进行扩增。

6．cDNA末端快速扩增法（RACE，rapid amplification of cDNA Ends）一般情况下很难通过逆转录将mRNA转录成全长cDNA，RACE方法是将转录本中的一个部位和3′或5′末端之间的区域进行PCR扩增。如果欲得到RNA3′末端的顺序，则其下游的引物是一个“杂合”的引物，即含有17个寡核苷酸的接头（adaptor），并用此引物进行逆转录反应，然后再用此引物和另一特异的上游引物进行PCR扩增。如欲得到mRNA 5′末端的顺序，可以用基因特异的引物进行逆转录反应，然后在其3′尾部加入一单核苷酸多聚体，用针对该单核苷酸多聚体的引物和基因特异的引物可以进行PCR反应。本方法的缺点的经常有非特异的扩增产物，但可以通过改善PCR条件而减少非特异的扩增产物。

7．差异显示PCR（differential display PCR） DD-PCR是1992年由哈佛大学的Peng Liang（梁朋）和Arthur B Pardee发明的一种分离特异表达基因的方法。

（1）一般策略：①将二组不同时相或不同组织的细胞抽提的mRNA逆转录成cDNA；②用PCR方法进行扩增，PCR产物用α-³⁵S标记的dATP标记；③在测序胶中电泳，放射自显影后进行差异比较；④将聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的条带；⑤进一步的鉴定和克隆。

（2）引物的选择：①3′端引物。利用存在于大多数真核细胞mRNA尾部的poly A顺序及位于poly A前的2个3′端碱基顺序，根据3′端的2个碱基的不同，引物有12种不同的组合，如引物T₁₁CA，T₁₁GA等。②5′端引物：是10个左右碱基的人为顺序，引物位置离poly A尾部距离是随即分布的，因此各种mRNA扩增产物的大小是不同的。

8．PCE-单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP） PCR-SSCP是目前用于筛选DNA单个碱基突变的方法，在PCR反应中，加入同位素标记的一种脱氧核苷酸，反应产物在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，不同DNA单链分子可因其构象的差异而被分开。在一段200～400bp的DNA分子中，即使单个碱基的突变亦可改变其构象。凝胶经放射自显影后，即可对电泳条带进行分析。如果发现异常条带，就可对异常条带进行测序分析。现在可以一些非同位素方法进行检测，以减少同位素的污染，如银污染等。

9．定量PCR 以下具体介绍。

（四）PCR技术的应用

1.DNA克隆用PCR扩增的DNA可以直接克隆至合适的质粒或M₁₃载体。设计PCR引物时可在5′端加入限制性内切酶位点，这样扩增的PCR产物用限制性内切酶消化而进行克隆，本方法比传统方法简单而快速。引物中任何碱基的改变应仅在5′端，而不要影响Taq DNA聚合酶的３′端延伸。PCR扩增25～28个周期所产生的DNA足以进行克隆，更多的PCR周期反而会产生非特异的产物。对于DNA末端平头的克隆，扩增产物的３′端用Klenow酶修补后再进行克隆。由于PCR方法可以掺入任何限制性内切酶位点或启动子序列，因此不需要应用定位突变的方法改变核苷酸顺序。

2．诊断

（1）细胞：PCR可以用于快速诊断一些病原体，特别是那些体外不容易培养或培养时间较长甚至无法进行体外培养的病原体。现在已有很多疾病可用PCR方法进行检测。如淋病、梅毒、支原体、结核、百日咳、细菌性腹泻等。

（2）病毒：PCR方法已成功地用于检测很多种与临床密切相关的病毒。如肝炎病毒（包括所有亚型的病毒）、先天性人类乳头状病毒（HPVS）、肠病毒（EV）、巨细胞病毒（CMV）、腺病毒（包括Ad₄₀和Ad₄₁）、EBV病毒、双链RNA病毒（如轮状病毒、感染性胰腺坏死病毒等）、细小病毒B₁₉和单纯疱疹病毒（HSV）等。逆转录病毒和人类多种疾病有关，如淋巴瘤、白血病、肉瘤和癌肿等，最近发现其与自身免疫怀疾病如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮以及引起贫血和免疫缺陷状态的细胞性疾病有关。HTLV-Ⅰ引起成人T细胞性淋巴瘤/白血病、骨髓瘤和免疫缺陷症，HTLV-Ⅱ引起T细胞和毛细胞白血病，HIV-1和HIV-2引起AIDS。此类病毒的培养费时、耗资，且往往是无结果。PCR的应用使逆转录病毒检测的可行性和灵敏度都大大提高。

（3）人类逆转录疾病：PCR已广泛地应用于遗传性疾病的分析。如次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）缺陷引起的X性联的遗传性致死性疾病Lesch-Nyhan综合征，单基因疾病β地中海贫血、血友病甲、血友病乙、巨大基因缺陷所致的杜氏肌萎缩症、HLA分型、反复血栓形成的抗凝血酶Ⅲ异常症、ABO血型检测等。

（4）法医分析及血缘关系的确认：当今DNA分析是法医分析最强有力的工具，分析结果与标本中DNA的质和量直接有关，而PCR可以将非常少量的起始DNA进行扩增，且对DNA的质量要求不高，所以特别适合法医学的检测。HLA-DQα系统的分型已经非常明确，因其高度多态性，有91%的机会可以将两个个体加以鉴别。此外，线粒体DNA是母系遗传的，因此特别适用于检测母相关的个体。

（5）人类基因组研究中的应用：PCR方法在人类基因组作图和测序的应用是非常重要的，人类基因组研究的目的是完成人类6万个基因的定位，并最终对整个基因组进行序列分析和弄清所有基因的功能。应用PCR技术产生的顺序标签位点（STS）是基因组作图和测序极其有用的工具。STS方法有助于对庞大的基因组进行分段，用于构建遗传和物理图谱，每一片段可检测到100～1000bp的部位，由此产生一些引物进行PCR扩增和测序。此外，应用PCR研究Alu或KpnⅠ重复序列的变异性，有助于对克隆的DNA片段进行指纹分析和产生新的STS。Alu-PCR则是制备染色体或区域特异探针的常用技术，与染色体特异区域的显微切割技术相结合，可用于克隆人类染色体的不同区域。新的DNA扩增仪的应用、PCR方法的改进以及Taq DNA聚合酶的应用将进一步提高人类DNA序列分析的准确性。

（五）PCR操作的注意事项

PCR是一种极为敏感的方法，只要有微量的PCR产物或模板污染即可造成大量的扩增，因此实验操作要特别仔细。

1．PCR反应前操作的场所和品格与反应后的应分开。

2．尽可能在超净台下工作。

3．有条件的应用一次性移液头。

4．全部缓冲液、移液头、离心管均需高压消毒。

5．操作时戴手套，并经常理更换

6．有关试剂均需小管分装，-20℃保存，避免反复使用造成污染。

7．所有试剂在开盖前均需离心，以免污染手套或移液枪。

8．在PCR反应中最后加入DNA模板，并防止形成气泡。

9．每次操作应设阳性和阴性对照。

10．用dUTP代替dTTP，并使用尿嘧啶-N-糖基酶（Uracil-N-Glycosylase，UNG）去除可能的PCR产物污染。

七、定量PCR技术

最初的PCR技术只是用于定性检测DNA或RNA，研究人员对PCR产物的数量并不重视，随着科学研究的逐步深入，人们开始考虑用PCR技术来进行DNA或RNA的定量检测。并出现了定量PCR技术（Quantitative PCR，Q-PCR）这一新名词。

（一）定量PCR的一些基本原则

从20世纪80年代后期到90年代中期，人们一直在研究定量PCR的实验方法。我们知道PCR可以将DNA或RNA序列扩增10⁶倍以上，这也是PCR最大的特点。但正是这一特点反而限制了研究者用PCR进行核酸的定量分析。我们从彩图6-1的PCR扩增曲线可以知道PCR产物的数量产生期可以分为3个时期：第1期是基准期，一般为第1～15个PCR反应周期，该阶段PCR 产物的增加处于缓慢状态。第2期是指数增长期，一般为第15～25个PCR反应周期，该阶段PCR产物的增加与循环圈数呈线性关系，此时的PCR产物增加最为明显。第3期是平台期，一般为第25个PCR 反应周期以后的阶段，该阶段由于Taq DNA聚合酶的活性降低、dNTP的消耗、PCR产物对反应的负反馈作用等一些抑制PCR反应的因素逐渐加强，使PCR 产物的增加又变得很缓慢，同时该时期非特异的PCR扩增和错误的扩增产物也会明显增多。因此只有指数期的PCR产物的数量与循环圈数呈线性关系，可以用来进行定量分析。所以进行定量检测时必须在指数扩增期采样。同时必须使用一些在各种组织各种状态表达稳定的基因（通常是管家基因）来进行标本间反应效率和上样量的校正。但必须使目的基因和管家基因等内对照基因的扩增效率尽量相同。目前常用的定量PCR技术根据采样点的差别分为终点法和实时法。以下分别予以介绍。

（二）终点法定量PCR

所谓终点法定量PCR是指在PCR结束以后根据最终的PCR产物量来决定模板中目的基因的数量。而根据所用内对照的区别终点法定量PCR又可以分为两种。

1．用管家基因进行相对定量在扩增目的基因的同时扩增管家基因（β-actin、GAP-DH等），PCR反应结束以后将产物通过琼脂糖电泳和溴乙锭染色后用密度扫描分别得到各标本的目的基因和管家基因的产物量，最后得到各标本间目的基因数量的校正值（目的基因数量/管家基因数量）的差别。一般用于检测一些在不同时相表达差别较大的基因，例如用药前后某基因表达量的改变、某基因在不同组织的表达差异等。这种方法只能得到目的基因的相对定量值，其定量的准确性和精确度都较差，同时受人为的因素影响很大。所以目前已经被淘汰，只用于一些对精确度要求不高的简单实验。

2．设计一种已定量的内参物来对目的基因进行定量分析一般来说设计的内参物具有以下特点：①扩增的片段大小和目的基因相似；②扩增的片段中GC含量与目的基因接近，引物的退火温度和扩增目的基因的引物接近；③该内参物已经被精确定量。在进行PCR反应时，目的基因和内参基因同时扩增，我们知道，这两种基因在反应体系中存在竞争机制，所以最终目的基因的产物量与内参基因的产物量成反比关系。我们可以通过内参物的量来决定目的基因的量。现在也有研究者在体外构建目的基因的突变子，这样一来可以和目的基因共用PCR引物，而简化实验方法。

总之，以上二种定量分析的方法都是采用终点法，在实践过程中存在一些问题：①实验以前必须完成预试验，使目的基因和内参基因的扩增都处于指数；②摸索出目的基因的内参基因的线性扩增范围，一般该范围只有2～3个数量级，即目的基因/内参基因为100：1～1：100的范围；③由于最终的结果取决与密度扫描的精度，所以终点法定量PCR分析技术的准确性受到限制。目前已经被最新的荧光实时定量PCR技术取代。

（三）荧光实时定量PCR技术

1．原理实时定量PCR引入特异的荧光探针技术（彩图6-2），该探针与PCR引物对内侧的一段序列同源。探针的5′端标有报告荧光（FAM、JOE），而在3′端则标有淬灭荧光（TAMRA），当探针保持完整时，报告荧光的发射波长被淬灭荧光的激发波光吸收，因此检测不到报告荧光的荧光信号。当PCR进行过程中，Taq DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性可以将荧光探针切成单个碱基，使报告荧光不再受淬灭荧光的影响，使报告荧光的荧光信号可被检测到，并随着PCR循环圈数的增加而增加荧光信号（彩图6-3）。在实时定量PCR系统中，我们将检测到的荧光信号强度（RQ）超过基础值10倍的循环圈数定义为循环阈值（cycle threshold，Ct）。因此当标本中模板拷贝数越多，则循环阈值越小，而模板拷贝数越少，则循环阈值越大，通过构建已知拷贝数的系列标准品的标准曲线就可以达到定量未知标本的目的（彩图6-4、6-5、6-6）。

2．荧光实时定量PCR的检测系统目前已经有很多公司推出了荧光实时定量PCR仪器，他们的基本功能相似。以下是PE-7700荧光实时定量PCR仪的工作原理（彩图6-7）。

（1）该系统内置了96孔的PCR仪，同时在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测PCR反应管中荧光强度。平均每8～12s就检测1次，这样一来就可以达到实时检测的目的。

（2）系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中荧光强度，并最终得到Ct值。

（3）该系统可以根据标准品的Ct值的拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。

3．TaqMan探针和引物设计的注意点

（1）TaqMan探针的序列必须和模板序列完全吻合，且必须位于引物对的中间，同时不能和两侧引物发生重叠。

（2）探针的长度以20～30个碱基为宜，以确保TaqMan探针和模板的杂交效率和特异性，GC含量控制在40%～60%。探针的Tm值必须高于引物10℃。

（3）如果在反应中使用AmpErase UNG，则探针和引物的Tm值必须高于55℃。

（4）避免在探针、引物以及探针与引物之间形成二级结构。

（5）探针序列需尽量避免单碱基的重复，特别是不可有3～4个G的串联重复，此外探针的5′端避免使用G。

（6）如果在一条给定的TaqMan探针和它的互补链探针之间选择时，一般地说选择C%高于G%的那一条探针。

4．荧光实时定量PCR技术的优越性

（1）由于该技术采用Ct值作为衡量样品中目的基因拷贝数的参数，所以保证了采样点处于PCR扩增的指数期。

（2）由于只有引物和探针都和模板上的特异序列互补以后，荧光探针才会被切割。这样就大大减少了非特异性扩增的干扰。

（3）该技术具有很高的重复性和可靠性。

（4）由于不需要通过电泳进行检测，所以反应后无须打开反应管，这样就减少了污染的可能性。

（5）荧光实时定量PCR技术使定量分析实现了高通量的目标。

5．荧光实时定量PCR技术的应用范围

（1）基因表达的检测：这一用途是应用最为广泛的。甚至可以进行基因表达谱的研究。

（2）药物治疗效果的判断：通过监测疾病相关基因表达水平的高低来判断药物治疗效果的好坏。

（3）DNA损伤情况的检测：在DNA损伤程度不同时，特异基因的表达水平也会有极大的差异，所以可以用定量分析法来判断DNA或RNA的损伤情况。

（4）转基因动物的研究：可以通过监测转基因动物体内的导入基因的表达情况来判断转基因工作的成功与否。

（5）基因治疗：虽然目前基因治疗处于研究阶段，但是我们可以通过检测导入基因的表达水平来指导临床试验和治疗。

（6）病原体的检测：如结核杆菌、各种类型的肝炎病毒等。

第三节应用PCR技术检测白血病融合基因转录本

PCR（polymerase chain reaction，多聚合酶链反应）技术是一种快速、敏感的方法，能够在几个小时内将单个分子的核酸扩增几百万倍，对于遗传性疾病的分子诊断和分子病理学研究是一项重大的革命。它可不经分子克隆及Southern或Northern转移的方法而对特异的基因顺序进行测定和分析，这种方法所需的组织标本量很少，只需少量的RNA或DNA，甚至可在单根发丝、漱口液或一滴干血中进行分析。应用PCR方法可将基因组DNA进行扩增，亦适用于RNA的扩增，但后者在进行PCR反应前，首先需将RNA逆转录成cDNA。一般在白血病的研究中均以RNA为模板进行PCR反应。同时为了提高方法的敏感性，以便对白血病残留病变进行监护，一般均采取二步法即筑巢式RT/PCR法。现在主要用于CML、APL、M_2b、ALL、M₄Eo等白血病融合基因的检测。

以下是简单的流程图：

骨髓细胞分离→骨髓细胞RNA的制备→RNA逆转录成cDNA→NEST PCR→电泳鉴定PCR产物。

一、Ph染色体相关白血病的检测

Ph染色体最初在慢性粒细胞性白血病（CML）中发现，其发生率达到90%以上，成为慢粒的细胞遗传学标志。该染色体是由于第9号染色体长臂3区4带（9q34）和22号染色体长臂1区1带（22q11）相互易位所致，其后果使位于9q34的原癌基因C-ABL和位于22q11的BCR基因发生融合，形成BCR-ABL融合基因，并表达为BCR-ABL融合mRNA，翻译成融合蛋白质。20世纪70年代以来，在部分急性淋巴细胞白血病（ALL）中也发现有Ph染色体，占ALL的5%（儿童）～25%（成人）。近年来由于PCR技术的不断发展，对Ph染色体阳性白血病的诊断和残留白血病细胞的检测有了很大的进展。

应用筑巢式逆转录酶/多聚酶链反应技术（RT/PCR）检测BCR—ABL融合基因转录本，发现了3种BCR-ABL异构体，这种异构体的形成是由于BCR基因断裂点的位置不同所致。慢粒患者在BCR基因的断裂点主要集中于经典的bcr区域，即M-BCR区域，而伴有Ph染色体急性白血病中，约50%的患者BCR基因断裂点与慢粒患者相同，而另50%患者的断裂点位于BCR基因的第1个内含子，ABL基因的断裂点主要位于第1或第2个内含子，第22号染色体的断裂点位于M-BCR2内含子，即M-BCR第二外显子与ABL基因第二个外显子相融合（简称b₂a₂转录本）。如果断裂点于M-BCR第三外显子即形成b₃a₂转录本，如果BCR基因的断裂点位于基因的第一内含子，则形成e₁a₂转录本，后者主要见于Ph染色体阳性的急性白血病患者。

二、急性早幼粒细胞性白血病的检测

急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中95%以上具有特异的染色体易位t（15；17）（q22；q21），易位的结果使第15号染色体长臂2区2带的早幼粒细胞白血病基因（PML）和第17号染色体长臂2区1带的维A酸受体α（RARα）基因形成PML-RARα融合基因转录本。由于该融合基因对APL具有高度特异性，因此可以作为APL诊断的分子标志。近年来各国科学家有在少数APL患者中陆续发现了变异型染色体易位t（5；7）、t（11；17）、dup（17）形成的NPM-RARα、PLZF-RARα、NμMA-RARα、STATSB-RARα融合基因，这对进一步研究APL的发生机制具有重要意义。同时在APL患者的鉴别诊断和治疗上具有积极的意义。

三、急性粒细胞性白血病（M_2b）的检测

急性粒细胞性白血病（M_2b）型患者中90%存在特异的t（8；21）（q22；q22）染色体易位，伴该染色体易位的白血病细胞具有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性和嗜酸性细胞，且对化疗反应较敏感。目前已经发现该染色体易位使8号染色体的ETO/MTG基因和21号染色体的AML₁基因融合形成AML1-ETO融合基因，从而导致产生AML₁-ETO嵌合转录子，这种异常转录因子有可能参与造血系统恶性肿瘤的发生，因此检测该融合基因转录本对急性粒细胞性白血病（M_2b）型患者的诊断、微小残留病变监测等具有重要意义。

四、AML-M₄伴嗜酸性细胞增多症中inv（16）导致CBF-MHY11融合基因的检测

近年来的研究发现在AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv(16)（p13；q22）的结果使16号染色体长臂的CBF（核心结合因子）β链基因和短臂的MYH₁₁基因发生融合，形成两种形式的融合基因，即CBFβ-MHY₁₁和MHY₁₁-CBFβ融合基因，其中前者对M4_Eo的致病可能更为重要。研究结果提示CBFβ基因的断裂点恒定于靠近3′端编码区的17个氨基酸处，而MYH₁₁基因的断裂点存在着至少3种不同的方式，同进这些重排仍然保持融合基因转录本的开放阅读框架。与其他类型的白血病发生的分子机制相似，CBFβ-MYH₁₁融合蛋白的产生将促使白血病的发生。特别有意义的是，本型白血病中的inv（16）与急性粒细胞性白血病（M_2b）型中的t（8；21）（q22；q22）染色体易位分别累及CBFα和β链，进一步说明了转录因子异常在白血病发病机制中的特殊地位。

与用PCR检测CBFβ-MYH₁₁融合基因时，必须检测所有可能的CBFβ-MYH₁₁融合基因转录本，这样才可以预防假阴性的结果。研究表明该融合基因在患者经治疗缓解后可以消失，所以该基因可以用于微小残留病变监测和预后判断。

五、t（6；9）与DEK-CAN基因

t（6；9）（p23；q34）染色体易位主要见于ANLL-M₂或M₄亚型中，也见于M₁亚型，且常是惟一存在的核型，在ANLL中的发生率为0.5%～4%，这种异常也存在于骨髓增生异常综合征（MDS）的难治性贫血伴原始细胞增多型（RAEB）中。伴有这种染色体异常的患者的年龄一般较轻，且预后较差。

1990年Von Lindern等研究发现t（6；9）易位分别累计6p23上的DEK基因和9q34上的CAN基因。6号染色体上的DEK基因长约40kb，而9号染色体上的CAN基因长约130kb。通过对伴有t（6；9）患者的Southern分析显示，6号染色体上的断裂点主要集中于DEK基因一个9kb的内含子中，称为icb-6（intron containing breakpoint on chromosome），9号染色体上断裂点丛集于CAN基因中部一个7.5kb内含子中，称为icb-9。正常情况下，CAN基因转录成一个6.6kb mRNA。由于t（6；9）易位，CAN基因的3′部分与DEK基因的5′部分发生融合，在6号染色体短臂上产生DEK-CAN融合基因，转录成一个异常的5.5kb mRNA，该异常融合转录本可以通过PCR的方法进行检测。

六、11号染色体长臂（11q23）异常和白血病的关系

许多造血系统恶性肿瘤如急性白血病（尤其是起源于粒-单核细胞者）、骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤等都与11号染色体长臂11q23的重排有关，重排包括部分缺失以及断裂点累计1、2、4、6、9、10、17、19号染色体的各种非随机染色体易位。在ANLL和ALL中均有11q23的受累提示存在着一种影响粒-单系和淋巴系方向分化的重要基因。Rowley、Cimino等研究将11q23的断裂点丛集区定位于CD3的PBGD之间一个被称为ALL-1（又称HRX）的新基因上。

伴有t（4；11）染色体易位的白血病常见于儿童ALL患者，该易位导致产生HRX基因和4号染色体上受累的基因（AF-4）发生融合，形成两种嵌合蛋白质，AF-4-HRX和HRX-AF-4，目前还不清楚其中哪一个融合基因的作用更为重要。而在t（11；19）易位的白血病患者中，HRX基因可与一个位于19号染色体上富含编码丝氨酸/脯氨酸的ENL基因相融合，形成HRX-ENL融合基因，该基因编码的嵌合蛋白也是一种重要的致病物质。目前HRX基因相关的融合基因都可以用PCR进行检测。

治疗血液病是一个需要坚定信念并且持之以恒的过程希望患者能树立正确的治疗观念坚持就会胜利！！！！袁六妮

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